強烈熾熱球菌幾丁質酶水解制備低脫乙酰度殼寡糖及其組成與結構分析

程 功，焦思明，任立世，馮 翠，康躋耀，杜昱光*

（中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

殼寡糖是由氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖或者二者的組合通過β-1,4糖苷鍵連接形成的寡聚物，聚合度小于20，相對分子質量小于3 900；通常由甲殼素或者其脫乙酰產物殼聚糖經過酸水解、物理水解或酶解等方法獲得[1]。殼寡糖具有調節免疫、抗腫瘤及誘導植物抗病抗逆與促進植物生長等生物活性[2-6]。與動植物及人體中的特定受體結合是殼寡糖發揮上述生物活性的重要方式。目前，已有多種可與殼寡糖特異性結合的受體被發現。比如，殼寡糖可與甘露糖受體特異性結合并激活巨噬細胞，其中，N-乙酰氨基葡萄糖在殼寡糖與甘露糖受體結合過程中發揮決定性作用[7-8]。在人體中還存在多種幾丁質凝集素，如YKL-39及YKL-40等，在炎癥發生、細胞增殖及自身免疫性疾病發生過程中發揮重要作用，均已被證實具有殼寡糖結合活性，且N-乙酰氨基葡萄糖在其中也起到決定性作用[9-11]。在植物中，已經鑒定出多種可與殼寡糖特異性結合的受體，如水稻幾丁質受體OsCEBiP及幾丁質和肽聚糖的共受體OsLYP4/OsLYP6等[12-15]。這些植物受體的共同特征是都具有可專一識別N-乙酰氨基葡萄糖的LysM結構，進一步說明該單糖組分在該類型配體受體識別過程中的決定性作用[16-17]。

在工業上，通常將甲殼素經堿法脫乙酰獲得殼聚糖，再經過酶法水解獲得殼寡糖[18-19]。由于使用的化學脫乙酰過程為非勻相反應過程，僅能獲得脫乙酰度大于85%的酸溶殼聚糖，以其為原料進一步水解獲得的殼寡糖脫乙酰度也大于85%。由于這些商品殼寡糖中所含的N-乙酰氨基葡萄糖組分已經較少，與專一性識別該單糖組分的特定受體的結合能力也相應較低，難以充分發揮其生物活性。因此，以低脫乙酰度（如脫乙酰度小于70%）殼聚糖為底物，通過酶解制備獲得富含N-乙酰氨基葡萄糖的殼寡糖，可能最大程度發揮其生物活性。目前，殼寡糖的活性及功能研究主要還是集中在高脫乙酰殼寡糖，低脫乙酰度殼寡糖的制備及功能研究仍然十分缺乏。

傳統方法制備的高脫乙酰度殼聚糖，因乙酰基被大部分脫除，只有殼聚糖酶才能對其進行較徹底水解以制備獲得殼寡糖。而低脫乙酰度殼聚糖，因保留較多N-乙酰氨基葡萄糖組分，除殼聚糖酶外，廣泛存在于動植物及微生物中的幾丁質酶也可對其較充分水解，從而可以用于制備具有新的結構特征的殼寡糖。多種商品酶，如纖維素酶、蛋白酶及脂肪酶等，因其中具有降解殼聚糖活性酶類，已被報道用于殼寡糖的制備，具有容易獲得且可規模化方法等優勢[20-24]。然而，這些粗酶中降解殼聚糖的活性酶類的具體蛋白組分仍不清晰，而且一些微生物發酵來源的商品酶中可能同時帶有多種殼聚糖酶及幾丁質酶，其降解產物的結構較為復雜，給后續組分分離及構效關系研究帶來困難。而利用表達的專一性殼聚糖水解酶類水解低脫乙酰度殼寡糖則可以獲得結構可控的殼寡糖。

在殼寡糖規模制備過程中，所用水解酶的耐高溫性能十分重要。在前期研究中，Oku等[25]發現來源于強烈熾熱球菌的幾丁質酶同時具有兩個水解活性結構域，且結構域2單獨使用時具有最高的幾丁質酶水解活性。該研究使用的底物為甲殼素，并沒有對該酶水解低脫乙酰度殼聚糖的能力及其產物結構特性進行鑒定。因此，本研究進一步確定其降解低脫乙酰殼聚糖的能力并對其水解產物的結構進行鑒定，可以為低脫乙酰度殼寡糖的規模制備及其結構與功能關系研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達載體pET28a為本實驗室保存；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、感受態細胞Escherichia coli DH5α及BL21 寶日醫（北京）生物技術有限公司；甲殼素（來源于蝦殼；貨號：900332） 美國Sigma-Aldrich公司；內切酶NdeI及BamHI、蛋白Marker（貨號：26617）、乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；混合多肽標準樣品、2,5-二羥基苯甲酸（貨號：201346）德國Bruker公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Autoflex III smartbeam型基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）儀 德國Bruker公司；AVANCE III 600MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士Bruker公司；TSK GEL4000PWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm） 日本Tosoh公司；高效液相色譜儀（配備可變波長紫外檢測器及蒸發光檢測器和色譜工作站） 華譜科儀（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 強烈熾熱球菌幾丁質酶基因全合成、克隆及表達

在本研究中，選擇強烈熾熱球菌幾丁質酶的結構域2（NCBI Reference Sequence: WP_011012376.1, 258-717）的編碼核酸序列進行全基因合成（委托上海生工生物工程有限公司完成），并在合成前在5’及3’末端分別添加NdeI及BamHI酶切位點以利于后續表達載體構建。使用NdeI及BamHI對合成的含有目的基因片段的質粒pUC57及表達載體pET28a進行雙酶切，分別回收目的片段及表達載體，使用T4連接酶進行連接并轉化至E. coli DH5α。提取重組載體質粒并使用上述雙酶切方法獲得正確的重組克隆，轉化至E. coli BL21中在16 ℃條件下使用異丙基硫代半乳糖苷誘導24 h。離心回收菌體并對其進行超聲破碎，進一步離心獲得上清液，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）查看蛋白表達情況。

1.3.2 低脫乙酰殼寡糖制備

低脫乙酰度殼聚糖的制備參考Kurita等[26]的方法。脫乙酰度測定使用1H NMR，具體方法為：稱取5 mg制備的殼聚糖，加入0.5 mL超純水及0.25 μL濃鹽酸，充分溶解后凍干，凍干樣品加入0.5 mL D2O，待其充分溶解后加樣檢測。以3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-D4鈉鹽為內標，參考Lavertu等[27]的方法計算其脫乙酰度。稱取1 g制備的部分脫乙酰殼聚糖，加入100 mL超純水及0.35 mL濃鹽酸，充分溶解后加入100 μL幾丁質酶誘導上清液，85 ℃攪拌反應24 h。反應結束后離心去沉淀，上清液經旋轉蒸發濃縮后凍干，用于后續分析。

1.3.3 低脫乙酰度殼寡糖分子排阻高效液相色譜（size exclusion high performance liquid chromatography，SEHPLC）分析

稱取10 mg殼寡糖樣品，溶解于1 mL超純水中，配成10 mg/mL殼寡糖溶液。具體分析方法為：使用TSK GEL4000PWXL凝膠色譜柱進行相對分子質量分布分析，以相對分子質量1 000、5 000及25 000的葡聚糖為對照，進樣量10 μL，流動相0.1 mol/L的甲酸銨（pH 3.2）；檢測器溫度50 ℃；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL，蒸發光檢測器進行檢測。

1.3.4 低脫乙酰度殼寡糖MALDI-TOF MS分析

吸取7 μL三氟乙酸于7 mL超純水中，配制成體積分數0.1%三氟乙酸溶液，再加入3 mL乙腈混勻，記為TA30溶液備用。稱取20 mg的基質2,5-二羥基苯甲酸，溶解于1 mL的TA30溶液中，配制成20 mg/mL基質溶液。稱取10 mg殼寡糖樣品，溶解于5 mL TA30溶液中，配成2 mg/mL殼寡糖溶液。吸取殼寡糖溶液1 μL于樣品靶上，待其自然干燥后再點上1 μL基質溶液，充分干燥。檢測樣品前先使用混合多肽標準樣品對相對分子質量進行校準。樣品靶放入MALDI-TOF MS后，使用正離子反射模式進行檢測。

1.3.5 低脫乙酰度殼寡糖NMR分析

使用1H NMR及13C NMR分別對酶解制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成進行分析，具體方法為：稱取25 mg制備的殼寡糖凍干樣品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加樣檢測。以3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-D4鈉鹽為內標，使用AVANCE III 600 MHz NMR儀對樣品進行檢測，其中，1H NMR檢測時對水峰進行抑制以減少其干擾。獲得的原始數據使用核磁分析軟件MestReNova打開后，使用內標校正位移值，參考Sasaki等[28]的方法對特定部位單糖進行標記，具體的參考位移值包括1H NMR中的還原端氨基葡萄糖（-D，δ 5.19）、還原端N-乙酰氨基葡萄糖（-A，δ 5.43）、還原端兩個連續N-乙酰氨基葡萄糖（-AA，δ 4.70）以及13C NMR中5位碳（C5）的非還原端氨基葡萄糖（D-，δ 79.0）、非還原端N-乙酰氨基葡萄糖（A-，δ 78.5）等。

2 結果與分析

2.1 強烈熾熱球菌幾丁質酶基因全合成、克隆及原核表達

將全基因合成的幾丁質酶基因（記為chiB）克隆至表達載體pET28a中，挑取3 個克隆菌落提取質粒及雙酶切電泳結果顯示，酶切產物E1及E2獲得了預期大小（1 395 bp）的片段，而酶切產物E3中沒有出現預期大小片段，說明為假陽性（圖1A）。E1原始質粒的雙末端測序結果確認目的基因被正確插入表達載體中。將E1原始質粒轉化至E. coli BL21中，對誘導表達產物P及其誘導前對照C進行SDS-PAGE分析，結果顯示，誘導后在40～55 kDa的位置出現了一個新的蛋白條帶，與chiB編碼的蛋白（記為CHIB）的理論分子質量50.6 kDa相符（圖1B）。

圖1 幾丁質酶基因chiB重組質粒酶切產物（A）及其蛋白表達產物（B）電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis maps of restriction enzyme hydrolysates recombinant plasmid harboring chiB gene (A) and protein expression products (B)

2.2 幾丁質酶CHIB水解制備低脫乙酰度殼寡糖及組分鑒定

為證實誘導表達的幾丁質酶具有殼聚糖降解活性，以制備的低脫乙酰度殼聚糖（1H NMR鑒定其脫乙酰度為62%）為底物，使用該酶的誘導上清液對其進行充分水解，對水解產物（記為CHIB-62）進行MALDI-TOF MS分析（圖2）以確定其主要寡糖組成。結果顯示，水解物中存在聚合度2～9、不同脫乙酰度的殼寡糖組分；所有的寡糖組分中均含有N-乙酰氨基葡萄糖，這也與幾丁質酶特異性識別該單糖相符。該結果也說明，利用全基因合成方法合成并克隆表達的CHIB確實具有幾丁質酶活性。

圖2 CHIB-62 MALDI-TOF MS分析Fig. 2 MALDI-TOF MS analysis of CHIB-62

2.3 低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62分子質量分布

MALDI-TOF MS方法在反射模式下只能對分子質量較小（如相對分子質量小于2 000）的組分進行測定。為確定CHIB-62中寡糖的真實分子質量分布，使用SE-HPLC對其進行分析。結果顯示，CHIB-62在1 000～5 000的相對分子質量范圍內均有殼寡糖分布（圖3）。以上結果說明，利用CHIB水解低脫乙酰度殼聚糖，除相對分子質量2 000以下的殼寡糖外，還可以獲得更高分子質量的產物。殼寡糖生物活性的發揮與其相對分子質量大小直接相關。因此，CHIB-62可能比傳統方法制備的高脫乙酰度殼寡糖（相對分子質量一般小于2 000）具有更高或者全新的生物活性。

圖3 CHIB-62的SE-HPLC圖譜Fig. 3 SE-HPLC analysis of CHIB-62

2.4 低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62末端結構鑒定

1H NMR對CHIB-62的末端結構分析結果顯示，CHIB-62中的殼寡糖還原端主要為兩個連續的N-乙酰氨基葡萄糖（-AA，圖4A）；13C NMR分析結果顯示，CHIB-62的非還原端主要為氨基葡萄糖（D-），也包含少量的N-乙酰氨基葡萄糖（A-），具體如圖4B所示。13C NMR結果還顯示，殼寡糖的中間區域單糖組成中，兩個連續的N-乙酰氨基葡萄糖結構（-AA-）明顯少于其他結構，而兩個連續的氨基葡萄糖（-DD-）則明顯多于其他結構，說明在幾丁質酶水解的過程中，前者（-AA-）容易被識別并水解，而后者（-DD-）則因不被水解而富集。該結果也與幾丁質酶的水解特性相符。Nakamura等[29]已經對CHIB中的催化區結構進行了解析，結果顯示，該酶屬于糖苷酶18家族，而該家族幾丁質酶水解的特征便是需要結合-1位的N-乙酰氨基葡萄糖，從而使其產物的還原端均由該單糖單元組成，這也與本研究1H NMR分析結果一致。1H NMR結果還進一步顯示CHIB的水解產物還原末端主要由-AA結構構成，這與來源于黏質沙雷菌的幾丁質外切酶的水解特性相似[30]。而前期結構鑒定結果提示CHIB為內切型幾丁質酶，水解實驗中，CHIB能夠對底物進行快速水解也初步驗證了該推測[25]。因此，CHIB作為來源于古菌的幾丁質酶，具有自身的水解特征，即可以通過內切方式快速水解低脫乙酰底物，獲得的產物末端主要由-AA結構構成。這些部分確定結構的殼寡糖對于其結構與功能關系研究意義重大。

圖4 CHIB-62的1H NMR（A）及13C NMR（B）鑒定Fig. 4 1H NMR (A) and 13C NMR (B) identification of CHIB-62

3 結 論

本研究利用全基因合成方法合成并克隆表達了來源于強烈熾熱球菌的幾丁質酶，并利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖制備了低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62。組分分離及結構鑒定結果顯示，CHIB-62的分子質量分布范圍為1 000～5 000，所有寡糖組分中均帶有N-乙酰氨基葡萄糖；不僅如此，寡糖的還原末端主要由兩個連續的N-乙酰氨基葡萄糖構成。與傳統殼寡糖相比，CHIB-62含有更多較高聚合度的殼寡糖組分，帶有更多的N-乙酰氨基葡萄糖且還原末端組分確定，可能具有新的或者更高的生物活性。后續將對這些組分進行分離并對其生物活性進行更深入研究。