釀酒酵母和大腸桿菌鳥嘌呤脫氨酶基因的克隆、原核表達及活性測定

孫 瑩，潘思安，李萌萌，鄧威威，張正竹*

（安徽農業大學 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036）

咖啡堿是茶葉中含量最高的生物堿，也是茶葉重要的滋味物質[1]，能興奮中樞神經從而消除疲勞感，還具有抑菌、抗癌、抗肥胖等功效[2]。在綠茶及烏龍茶這些不發酵茶或為發酵茶的加工過程中，咖啡堿含量基本保持穩定或有些微的降低[3-4]，而在普洱茶和茯茶等黑茶加工中，由于大量微生物參與了渥堆發酵過程，導致產品中咖啡堿含量的明顯增長[5-6]。咖啡堿含量的消長是黑茶品質形成及其健康功能的重要物質基礎。目前，國際市場上的咖啡堿主要來源于化學合成，受潛在的化學污染物質量安全風險影響，其在食品行業和醫藥產業中的應用受到限制[7]。因此，污染低、安全性高的生物合成咖啡堿越來越受關注。

在富含咖啡堿的植物，如咖啡和茶樹中，咖啡堿合成路徑是黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-堿基黃嘌呤→可可堿→咖啡堿，即是以黃嘌呤核苷為底物，以N-7、N-3、N-1順序進行3 次甲基化[8-10]。此外也有研究指出微生物中咖啡堿合成可能還存在一條有別于植物體內合成咖啡堿的途徑，以N-3、N-1、N-7的順序進行甲基化，以黃嘌呤為底物逐步生成咖啡堿[11-12]。因此，在微生物中增加咖啡堿合成途徑中黃嘌呤的含量，對實現咖啡堿無底物從頭合成及提高咖啡堿產量都具有重要的現實意義。

鳥嘌呤脫氨酶又稱鳥嘌呤酶或鳥嘌呤氨基水解酶，是一種鋅金屬酶[13]，也是核苷酸代謝的關鍵酶，分別在1982、1998年及1999年被證實可在脈孢菌、嗜鹽古菌和哺乳類動物中催化鳥嘌呤脫氨降解生成黃嘌呤后合成核苷酸[14-17]。嘌呤、嘧啶在作為碳源及氮源時，脫氨步驟是第一步，這也是降解途徑和補償途徑的基礎步驟[18]。但是因為嘌呤代謝的補償途徑是不對稱的，只有腺嘌呤衍生物可以轉變成鳥嘌呤核苷酸，而相反的路徑卻不存在，因此鳥嘌呤脫氨酶在鳥嘌呤分解代謝中扮演著重要角色[19-20]。植物體中關于鳥嘌呤脫氨酶的研究較少，Negishi等[21]曾在茶樹葉片中檢測到了鳥嘌呤脫氨酶活性，只是尚未發現完整的基因序列。目前關于鳥嘌呤脫氨酶的研究主要集中在動物肝臟及微生物方面[22-23]。研究顯示，雖然鳥嘌呤脫氨酶是嘌呤代謝基礎酶，但是在哺乳動物體內分布并不均勻，例如在小鼠體內是在小腸近端部分含有最高水平，僅在小鼠腦內不同區域鳥嘌呤脫氨酶含量就有近50 倍的差異[16,24-26]。本研究分別從釀酒酵母和大腸桿菌中克隆出鳥嘌呤脫氨酶基因gud1和egud，構建重組載體進行原核表達分析，嘗試在生物體內大量積累黃嘌呤，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測體內及體外產物，分析鑒定基因功能，嘗試為豐富黑茶加工技術理論作出探索，同時為無底物合成咖啡堿和提高咖啡堿產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）、感受態大腸桿菌TransT1、DNA Marker、Protein Marker II 北京全式金公司；表達載體pMAL-c5X由安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室提供；rTaq酶、限制性內切酶 寶生物工程（大連）有限公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit 諾唯贊生物科技有限公司；引物合成及測序由通用生物系統（安徽）有限公司完成；HPLC所用試劑均為色譜級，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Alliance高效液相色譜儀、ODS C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Waters公司；S1000TMThermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統（ChemiDocTMMP Imaging System）、Power PAC 3000電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝儀器研究所；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DHG-9031A電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；LDZF-50L高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit克隆目的基因

根據gud1和egud序列，按試劑盒說明，利用CE Design V1.04軟件設計兩對特異性引物，將gud1和egud分別連接到pMAL-C5X。為方便連接目的基因和表達載體，在引物中引入BamHI酶切位點，引物序列如下（下劃線處為添加的酶切位點）：egud-F：5’-cgcgatatc gtcgacggatccATGATGTCAGGAGAACACACGTTA-3’，egud-F：5’-acctgcagggaattcggatccTTAGTTGCGTTCGTA CACCAGACG-3’；gud1-F：5’-cgcgatatcgtcgacggatccATG ACAAAAAGTGATTTATTATTTGATA-3’，gud1-F：5’-ac ctgcagggaattcggatccCTAAATCTGGTAGACTTGCTGG CC-3’。

以大腸桿菌BL21（DE3）菌株和釀酒酵母INVSCI菌株為試材，因兩種菌株皆沒有內含子，直接以粗樣品為模板，用KOD FX Neo擴增egud和gud1。PCR體系：2×PCR buffer 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，KOD FX Neo 1 μL， Primer F（10 μmol/L）1.5 μL ，Primer R（10 μmol/L）1.5 μL，補ddH2O至50 μL，超凈臺中挑菌少許，該體系均分成2 管進行PCR。PCR程序（35 個循環）如下：94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 80 s，68 ℃ 10 min，4 ℃ ∞。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶。

1.3.2 原核表達載體的構建與鑒定

對表達載體質粒pMAL-c5X進行單酶切，酶切體系為：10×K buffer 2 μL，BamHI 1 μL，DNA 2～5 μL（不大于1 μg），補ddH2O至20 μL。上述體系30 ℃水浴條件下反應1 h，產物經電泳檢測后，用膠回收試劑盒純化產物。與PCR回收產物重組連接，反應體系：5×CE II buffer 4 μL，Exnase?II 2 μL，Linearized Vector 5 μL，Purified PCR Fragment 0.5 μL，補ddH2O至20 μL。上述體系于37 ℃反應30 min進行連接，反應完成后及時冰浴5 min終止反應，將10 μL連接產物轉入50 μL大腸桿菌TransT1感受態細胞，冰浴30 min，然后將離心管置于45 ℃水浴45 s，冰浴中冷卻2 min。在超凈工作臺中分別向離心管中加入500 μL LB培養基，混勻后37 ℃條件下200 r/min培養1 h。1 h后吸取100 μL菌液均勻涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養。挑取單菌落于含氨芐抗性的LB固體培養基平板上劃線，37 ℃培養后蘸取少量菌體進行菌落PCR，挑取陽性菌落送通用生物系統（安徽）有限公司測序。將測序正確的陽性菌落挑菌初步培養，用試劑盒提取重組質粒轉入至大腸桿菌BL21（DE3）。

1.3.3 重組蛋白的誘導表達

篩選陽性菌落于3 mL LB培養基中，37 ℃條件下200 r/min振蕩過夜培養。次日取800 μL過夜菌液接種于40 mL新鮮LB培養基，繼續37 ℃振蕩培養至OD值為0.6～0.8。取1 mL菌液于12 000 r/min下離心5 min后，取上清液作為誘前對照。在剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導，分別16 ℃誘導20 h，30 ℃誘導8 h，確定最佳誘導溫度及時間。

1.3.4 酶活性檢測

1.3.4.1 體外酶活性檢測

選取最佳誘導條件，進行融合蛋白的誘導表達，200 mL誘導后菌液冷凍離心（4 ℃，6 000 r/min）20 min收集菌體。加入20 mL Lysis Buffer（現加二硫蘇糖醇，終濃度為5 mmol/L）重懸菌體，冰浴條件進行超聲破碎，破碎結束離心得上清液即粗酶液，將粗酶液過麥芽糖結合MBP層析柱進行純化。

5 mL酶反應體系[20]：MgCl2250 μL，鳥嘌呤溶液50 μL，純化后的酶液200 μL，無菌水4.5 mL，混合體系37 ℃反應，分別取反應0、5、10、30、60 min的樣品，離心后過0.22 μm水相濾膜，通過HPLC檢測酶反應產物。以未插入目的基因的空載體pMAL-c5X相同處理作對照。

1.3.4.2 體內酶活性檢測

40 mL菌液誘導后，分為兩組，一組不作處理，一組加入4 mL質量濃度為5 mg/mL的鳥嘌呤為底物，將菌液移入37 ℃繼續培養，每隔24 h取一次樣，將菌液12 000 r/min離心10 min，按1∶50的比例取上清液稀釋，稀釋液過0.22 μm水相濾膜，通過HPLC檢測酶反應產物。

高效液相色譜條件：流速1 mL/min；流動相：A相0.2%乙酸，B相純乙腈；紫外檢測器吸收波長為274 nm。線性變化范圍：0～4 min，A相95%，B相5%；4～10 min，A相40%，B相60%；10～13 min，A相95%，B相5%；13～30 min，A相95%，B相5%。

1.3.5 表達酶的同源建模以及二級結構預測

采用DNAMAN軟件進行GUD1和EGUD的氨基酸序列進行分析比對比，參考Dai Xinlong等[27]的建模方法，使用SWISS-MODEL在線軟件（http://swissmodel.expasy.org/interactive）利用相似度高的已知三維結構的蛋白酶的晶體結構模型，對GUD1和EGUD進行蛋白三維結構的同源建模，并使用Molegro virtual docker軟件以此對目的蛋白二級結構進行了預測。

1.4 圖像處理

PCR擴增圖像、結合蛋白誘導表達圖像及蛋白純化圖像都是利用伯樂ChemiDoc?MP Imaging System照膠成像所得并進行后續編輯；色譜圖為HPLC儀檢測編輯并用Excel進行后續處理；蛋白晶體模型使用Molegro virtual docker軟件進行編輯。

2 結果與分析

2.1 gud1和egud的原核表達載體的構建

挑取少量大腸桿菌BL21（DE3）和釀酒酵母INVSCI，用KOD FX Neo分別擴增gud1和egud（圖1），在1 000～2 000 bp之間分別可見兩條特異性條帶，產物大小與gud1 ORF的長度1 470 bp、egud ORF的長度1 320 bp相符。回收PCR擴增產物，與pMAL-c5X表達載體通過Exnase?II重組連接，構建pMAL-gud1和pMAL-egud表達載體。

圖1 gud1和egud編碼區的擴增Fig. 1 Amplification of encoding regions of gud1 and egud genes

2.2 pMAL-egud和pMAL-gud1誘導表達及蛋白純化

為確定EGUD和GUD1蛋白最佳誘導條件，加入1 mmol/L IPTG在16 ℃和30 ℃分別誘導20 h和8 h，制樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測。在兩個溫度下均可誘導得到90 kDa左右的可溶性目的蛋白（圖2），與融合蛋白大小一致（空載標簽子MBP大小為40 kDa，EGUD和GUD1蛋白理論值大小51.22 kDa和55.21 kDa）。而且16 ℃誘導20 h蛋白表達效果明顯比30 ℃誘導效果好，融合蛋白大量表達在上清液中，因此后續實驗均在16 ℃、20 h誘導條件下進行。將菌液誘導結束后制取粗酶液，利用麥芽糖結合MBP層析柱進行純化，獲得單一條帶（圖3）。

圖2 pMAL-egud和 pMAL-gud1誘導蛋白SDS-PAGE圖Fig. 2 Induced protein expression of pMAL-egud and pMAL-gud1 revealed by SDS-PAGE electrophoresis

圖3 pMAL-gud1、pMAL-egud目的蛋白純化Fig. 3 Purification of target protein pMAL-gud1 and pMAL-egud

2.3 EGUD和GUD1體外活性檢測結果

圖4 pMAL-gud1和pMAL-egud產物體外酶活性的HPLC分析Fig. 4 In vitro activity analysis of pMAL-gud1 and pMAL-egud by HPLC

如圖4所示，對照組pMAL-c5X無法生成黃嘌呤，與對照組相比，樣品組pMAL-gud1和pMAL-egud添加的底物鳥嘌呤均有所下降并且生成黃嘌呤質量濃度分別達到了619.3 μg/mL和527.9 μg/mL。

2.4 EGUD和GUD1體內活性檢測結果

圖5 pMAL-gud1和pMAL-egud產物體內酶活性的HPLC分析Fig. 5 In vivo activity of pMAL-gud1 and pMAL-egud analyzed by HPLC

菌液誘導后制樣通過HPLC檢測EGUD和GUD1體內酶活性，結果見圖5。在兩種處理下，對照組中轉入空載的菌株也都能產生黃嘌呤，但是與重組菌株相比較發現，無底物培養時重組菌株產物明顯黃嘌呤產量高于對照組，轉入pMAL-gud1和pMAL-egud質粒的實驗組菌株對照轉入空載質粒的對照組菌株，黃嘌呤產量由110 μg/mL分別提高到225 μg/mL和191 μg/mL；加底物培養時實驗組底物鳥嘌呤消耗速度相比對照組更快，且黃嘌呤的產量更高，轉入pMAL-gud1和pMAL-egud質粒的實驗組菌株對照轉入空載質粒的對照組菌株，黃嘌呤產量由180 μg/mL分別提高到312 μg/mL和267 μg/mL。

2.5 EGUD和GUD1的同源建模及二級結構預測

通過SWISS-MODEL在線軟件對GUD1和EGUD蛋白進行同源建模，分別以Guad（SMTL id：2uz9.1）和Blr3880（SMTL id：200D.1）蛋白為模型，建造了GUD1和EGUD的三維晶體模型（圖6），重合度分別達到了41.15%和44.72%，并以此對二者的二級結構進行了預測，如圖7所示，GUD1二級結構以α-螺旋為主，α-螺旋較多較集中，EGUD二級結構中α-螺旋與β-折疊程度相似，但是β-折疊較α-螺旋更為分散。

圖6 GUD1和EGUD三維晶體同源建模Fig. 6 3D crystal modeling of GUD1 and EGUD

圖7 GUD1和EGUD二級結構預測Fig. 7 Predicted secondary structures of GUD1 and EGUD

3 討 論

本研究在大腸桿菌中分別轉入釀酒酵母的鳥嘌呤脫氨酶基因gud1和大腸桿菌鳥嘌呤脫氨酶基因egud構建重組質粒。由于低溫有利于增強蛋白的穩定性和正確折疊，獲得可溶性蛋白的可能性較大，而不易形成包涵體[28]，所以實驗過程中利用IPTG在16 ℃低溫誘導，從而使大腸桿菌中可以大量產生黃嘌呤。本研究構建的工程菌在轉入含gud1和egud的質粒后，對比轉入空載pMAL-c5X的大腸桿菌，在加入鳥嘌呤作底物時，120 h后黃嘌呤產量由180 μg/mL分別提高到312 μg/mL和267 μg/mL，鳥嘌呤消耗速度分別提高了61%和49%；在不加入底物的情況下，120 h后黃嘌呤產量由110 μg/mL分別提高到225 μg/mL和191 μg/mL。對分別轉入gud1和egud的菌株相進行比較，前者生成黃嘌呤的效率更高，說明GUD1比EGUD催化效率更高，有更高的酶活性。可能是因為鳥嘌呤脫氨酶催化鳥嘌呤脫氨生成黃嘌呤是初級代謝反應，相比于大腸桿菌，酵母是真核生物，有更為復雜的生理代謝，導致基礎代謝也更為旺盛，或鳥嘌呤脫氨酶有不同的折疊方式和晶體結構，在真核生物和原核生物中因三維結構不同造成GUD1比EGUD酶活性更高[29]。后續研究中可以考慮通過以下措施優化基因表達，提高黃嘌呤表達量：控制培養條件以提高質粒穩定性與拷貝數，減少代謝副產物積累，提高外源蛋白產率；更換表達載體，將Lac啟動子換成更強的T7啟動子等[30-31]。

與綠茶等不發酵或輕微發酵茶相比，茶葉中內源酶在殺青過程中已經失活，渥堆和發花過程中，微生物來源的外源酶成為發酵中最主要的生物催化劑，在適宜的水分和溫度條件下，黑曲霉、冠突散囊菌、酵母等微生物以茶葉中存留的鳥嘌呤等堿基為底物合成了黃嘌呤，為渥堆和發花過程中咖啡堿的生物合成提供了底物[32]。

目前，咖啡堿在植物中的生物合成途徑已經基本明確，但是構建工程菌生物合成咖啡堿應還有待進一步研究。本研究以黃嘌呤為底物合成咖啡堿的新途徑入手，通過提高咖啡堿合成途徑中底物黃嘌呤的生成量，以期達到提高咖啡堿合成量的目標。研究結果表明，無論是否添加外源底物（鳥嘌呤），轉入gud1和egud的菌株都明顯比對照菌株生成了更多的黃嘌呤。研究結果將為黑茶渥堆技術提供一定的理論基礎，同時為體外構建高效咖啡堿生物工程菌提供依據。