離子阱質譜測定脂質鑒別深海魚油

李 鑫，劉 霞*，李培武*，王秀嬪

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；

2.中國農業科學院油料作物研究所，農業部油料作物生物學與遺傳改良重點實驗室，農業部油料及制品質量監督檢驗測試中心，農業農村部油料產品質量安全風險評估實驗室（武漢），農業部生物毒素檢測重點實驗室，湖北 武漢 430062）

自20世紀70年代，深海魚油被報道含有多元不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），深海魚油就一直以其在保健、疾病預防等方面的顯著作用而備受人們關注[1]。深海魚油中的主要營養物質是EPA和DHA，其對精神疾病如各種類型的癡呆、認知障礙[2-3]、阿爾茲海默病等[4-6]表現出明顯的治愈效果；對于降低血脂[7]、預防腦血栓[8-9]、中風及腦溢血、預防血液凝固等心血管疾病也有顯著療效[10-11]；同時也有研究表面，深海魚油中的不飽和脂肪酸與人體腫瘤、糖尿病、抗炎機制[12-13]等都有著密切相關[14-18]。

目前市場上的深海魚油主要分為乙酯型和甘油酯型2 種，2 種不同類型的深海魚油功效不同，價格差異大。甘油酯型魚油是DHA和EPA天然的存在形式，食用安全，易被人體消化吸收[19]，是人們能普遍接受的一種產品形式。據報道[20-21]，2 種不同類型的深海魚油有著較大差異，甘油酯型魚油與乙酯型魚油相比，其吸收率高達乙酯型魚油的3 倍，因為甘油三酯能被人體胰臟和肝臟的主要脂肪酶專一性水解[22-23]，而乙酯型魚油卻不能被有效水解而釋放游離脂肪酸以被人體吸收[24-25]。此外，乙酯型魚油也有著功能上的缺陷，乙酯型魚油在胃腸道能分形成乙醇，對乙醇耐受性不良的人容易引起不良反應，如過敏癥，尤其不適宜兒童食用；乙酯型魚油脂肪酸被小腸吸收后進入人體通常會被作為能源物質供能而被氧化，影響了魚油的保健功效[26-27]；長期以脂肪酸、乙醇作為膳食來源，也易引起人體內甘油的缺失或不足，從而拉動人體糖代謝，這樣易造成人體內糖代謝不平衡從而產生一定的副作用[28-29]。目前對于2 種不同類型深海魚油的鑒別研究還鮮見報道，對深海魚油中不飽和脂肪酸如EPA、DHA的研究主要通過氣相色譜、液相色譜-質譜聯用[30-31]等手段，其前處理復雜、需要衍生，成本損耗較大，且精密度不高[32-33]。本研究運用高效液相色譜-離子阱質譜的方法，通過數據依賴型掃描所獲得的一級精確質量數，加以二級特征分子碎片離子峰的輔助驗證，能準確鑒別乙酯型和甘油酯型的深海魚油，具有快速、簡便、靈敏度高、準確性高的優點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品牌深海魚油樣品（乙酯型深海魚油2 個，甘油酯型深海魚油7 個） 市購；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；異丙醇（色譜純） 北京百靈威科技有限公司；正己烷、乙腈（均為色譜純） 安徽時聯特種溶劑股份有限公司；乙酯酰基EPA、乙酯酰基DHA、十六碳烯酸甘油酯標準品（純度＞97%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-質譜聯用儀（Surveyor液相色譜儀包括四元輸液泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、LTQXL質譜檢測器、離子源為大氣壓化學電離源）、Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm） 美國Thermo Scientific公司；CPA224S電子分析天平 德國Sartorius公司；微量移液槍 德國Eppendorf公司；KQ-300E超聲儀 中國昆山儀器有限公司；0.22 μm一次性有機濾膜 美國Millipore公司；HQ-60型渦旋混合器北方同正生物技術發展公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取30 mg深海魚油，采用異丙醇-乙腈-正己烷（2∶2∶1，V/V）混合溶劑提取獲得其中脂質組分后，用甲醇-異丙醇（1∶1，V/V）溶液稀釋100 倍，經0.22 μm的有機濾膜過濾后，進樣到高效液相色譜-質譜聯用儀中分析，進樣量10 μL。

1.3.2 色譜條件

Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相A相為異丙醇，B相為乙腈，梯度洗脫：0 min，10% A，90% B；20 min，59% A，41% B；20.01～25 min，10% A，90% B（按體積分數計）；流速200 μL/min；進樣量10 μL。

1.3.3 質譜條件

大氣壓化學電離源；正離子采集模式；掃描模式：數據依賴型二級掃描；質量掃描范圍m/z 100～1 200；離子源溫度275 ℃；毛細管溫度275 ℃；鞘氣壓力30 psi；輔助氣壓力5 psi；碰撞能量35 eV。

1.4 數據處理

根據采集到的質譜圖和出峰保留時間與脂質數據庫（http://www.lipidmaps.org/）比對，進行定性分析。數據處理采用Xcalibur軟件（Version 2.0.7，美國Thermo公司），對峰面積積分并計算，進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA識別及多級質譜特征

圖1 乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA一級質譜圖（A）及其對應二級質譜圖（B、C）Fig. 1 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B, C) of ethyl acetyl EPA and ethyl acetyl DHA

如圖1A所示，乙酯酰基EPA特征分子離子峰（[CH3CH2O-EPA＋H]＋，m/z 331.3）和乙酯酰基DHA特征分子離子峰（[CH3CH2O-DHA＋H]＋，m/z 357.4）。如圖1B、C所示，在分子離子峰二級全掃描質譜圖中分別出現了其碎片離子[EPA-OH]＋（m/z 285.27）和[DHA-OH]＋（m/z 311.28）。

2.2 三酰甘油酯識別及多級質譜特征

圖2 PoEPADHA一級質譜圖（A）和對應二級質譜圖（B）Fig. 2 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B) of PoEPADHA

三酰甘油酯在離子阱多級質譜中的碎裂方式是一級分子離子峰會任意丟失一個脂肪酸中性碎片而形成二級碎片離子，通過將一級分子離子和二級碎片離子信息與脂質數據庫（http://www.lipidmaps.org/）進行比對，并結合一級分子離子和二級碎片離子的m/z特征信息可推測丟失的脂肪酸種類，從而識別甘油三酯，如圖2A所示，一種甘油三酯組分PoEPADHA的分子離子峰[PoEPADHA＋H]＋（m/z 923.63）會失去任意一個脂肪酸中性碎片而形成二級碎片離子[EPADHA]＋（m/z 671.50）、[PoDHA]＋（m/z 621.50）和[PoEPA]＋（m/z 595.47），見圖2B，由此可識別該組分為PoEPADHA。

2.3 乙酯型深海魚油和甘油酯型深海魚油脂質差異分析

表1 甘油酯型魚油中甘油三酯定性結果Table 1 Qualitative analysis of triglycerides of glyceride-type fish oils

如圖3A所示，2.86 min處有乙酯酰基EPA分子離子峰（[CH3CH2O-EPA＋H]＋，m/z 331.34）和乙酯酰基DHA分子離子峰（[CH3CH2O-DHA＋H]＋，m/z 357.41）的色譜峰。如圖3B所示，5.5～18 min之間的峰為甘油酯型深海魚油中脂質組分包括三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA多組分的手指形色譜峰。甘油酯型深海魚中可識別的甘油三酯見表1。因此，鑒別乙酯型深海魚油和甘油酯型深海魚油的方法為只含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，該樣品即為乙酯型深海魚油；樣品中只含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，且不含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，該樣品即為甘油酯型深海魚油。

2.4 鑒別方法驗證結果

表2 不同脂質在魚油樣品中的相對含量Table 2 Relative contents of different lipids in fish oil samples

選用9 份魚油樣品進行方法驗證，如表2所示。乙酯型魚油特征標志物CH3CH2O-EPA，CH3CH2O-DHA存在于樣品2和樣品9中，而在其他樣品中未檢出。同時樣品1、3～8中只存在甘油酯型魚油的特征物。由此可說明，樣品2、9為乙酯型魚油，其余為甘油酯型魚油。

3 結 論

本研究建立基于高效液相色譜-離子阱質譜儀的脂質識別技術，以及鑒別乙酯型和甘油酯型深海魚油的方法。通過總離子流、一級質譜和二級質譜離子樹識別脂質指紋信息，從而對魚油樣品進行定性，可精確鑒別乙酯型魚油和甘油酯型魚油，具有快速、準確、靈敏度高的優點。該技術的建立為保證市場上深海魚油的質量安全提供理論依據。