響應面法優化海帶脫腥工藝及其色澤品質評價

顧賽麒，唐文燕，周洪鑫，張晨超，劉 璘，周緒霞，丁玉庭*

（浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州 310014）

海帶（Laminaria japonica）是一種生長于低溫海水中的大型海生褐藻植物，其質地脆嫩，口感良好，營養豐富，含有多種生理活性成分，具有較高的藥用保健功效，廣受消費者青睞[1-2]。然而，新鮮海帶腥味較重（遠超淡水產品），降低了部分消費者對其喜好性，同時也對海帶制品的感官品質造成了一定影響，阻礙了海帶加工產業的發展[3]。

海帶的腥味物質構成復雜，主要包括有機嗅代物或碘代物、醇類、醛類和烯酮類等[4-6]。目前，常采用物理法、化學法和生物法對海帶進行脫腥處理[7]。物理法和化學法主要通過屏蔽、掩埋或吸收等方式降低腥味物質濃度，而生物法脫腥的原理是：1）將小分子的腥味物質經微生物的合成作用轉變成為無腥味的大分子物質；2）在微生物酶的作用下，腥味物質分子經結構修飾后轉變為無腥味成分。經對比發現，生物法的脫腥效果最好，其常用菌種有酵母菌、乳酸菌和醋酸桿菌等[7]，其中酵母菌的脫腥效果較優。國內外已有一些海帶脫腥加工的相關報道，祖國仁等[8]報道采用3 種不同酵母菌對裙帶菜浸提汁進行脫腥處理，發現均能有效去除腥味成分。段吳勇[9]利用0.70×108CFU/g的酵母菌對海帶脫腥，發現在33 ℃發酵2 h時脫腥效果較好。Seo等[10]經研究證實微生物發酵是減少海帶異味的有效手段。

在生物法脫腥過程中，若發酵條件（酵母添加量、發酵溫度、發酵時間）控制不當，一方面可導致脫腥效率偏低，另一方面還可能對海帶色澤造成不利影響（如綠色消失、褐色加深），分析原因：發酵過程中產生的酸類物質（碳酸等）可使發酵液的pH值顯著下降，造成海帶中葉綠素結構發生破壞（脫除鎂離子或自身結構完全分解）[11]。此外，若發酵溫度過高，也會對葉綠素結構造成不利影響。綜上所述，選取適宜的發酵條件，在脫腥處理的同時盡可能保持海帶原有色澤，可顯著提高海帶加工制品質量。然而，多數研究者在優化海帶脫腥工藝的同時，未全面考察海帶色澤相關指標（色差值、葉綠素含量等）的變化規律。

本實驗選取不同工藝發酵后的海帶作為研究對象，綜合考察感官評分、pH值、色差、葉綠素含量的結果，確定各因素的較優作用水平。基于響應面設計獲得海帶發酵法脫腥的最優工藝，并進一步分析脫腥前后海帶的揮發性風味成分變化，旨在為海帶制品加工企業提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶于2016年5月購自山東榮成尋山集團；釀酒高活性干酵母（貨號：E80000012） 湖北安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、氯化鈉、丙酮、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；C5～C40正構烷烴標準品、2,4,6-三甲基吡啶標準品（均為色譜純）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HR2860型打漿機 德國飛利浦有限公司；220A型分析天平 瑞士Precisa儀器有限公司；YP3001N電子天平、PHS-3C型數顯酸度計 上海精密科學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；SKY-200B恒溫振蕩搖床 上海蘇坤實業有限公司；LRH-250F生化培養箱 上海一恒科技有限公司；UV759紫外-可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司；CQX3448色差儀 美國Hunter Lab公司；固相萃取整體捕集劑MonoTrap RCC18（簡稱MTRCC18，規格2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm） 日本GL Sciences公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 脫腥處理

酵母活化液的制備：稱取20 g葡萄糖和0.6 g NaCl加入2 000 mL蒸餾水中，充分攪拌使其完全溶解，在上述溶液中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g安琪酵母干粉，依次配制成質量分數為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的酵母菌液（菌體濃度分別為7.85、8.15、8.32、8.45、8.54（lg（CFU/g））），將其置于轉速為120 r/min的恒溫搖床中，25 ℃活化20 min。

海帶脫腥工藝：稱取1 kg原料海帶，將其剪成規格為1 cm×1 cm的小塊。稱取10 g剪碎后海帶裝入250 mL具塞錐形瓶中，向其中加入100 mL酵母活化液，將錐形瓶置于恒溫搖床內，于不同溫度（24、26、28、30、32 ℃）發酵脫腥不同時間（30、60、90、120、150 min）。將脫腥后的海帶取出，以蒸餾水沖洗干凈，并用紙巾擦干表面。以上海帶一部分用于感官評定與色差測定，剩余部分在冰浴條件下打碎至均勻，用于其他指標的測定。

1.3.2 感官評定

參照Dooley等[12]的方法并稍作修改。召集10 名（5 男5 女，平均年齡24 歲）具有食品感官評定經驗的人員組成評定小組，采用劃線法對脫腥后的海帶進行感官評定。各評價員在一根總長為10 cm的線段上進行劃線，劃線長度代表海帶樣品氣味的“可接受度”（從腥味消除與異味生成兩方面綜合評定）。將劃線長度除以10 cm再乘以100，轉化后即可獲得“可接受度”的百分制分數為受評海帶樣品的感官評分：滿分100 分，表示樣品氣味完全可以接受；0 分表示完全不能接受。評定結果以10 名評價員打分的平均值表示。

1.3.3 pH值測定

將1.3.1節中脫腥完畢的海帶發酵液以漏斗過濾，采用pH計測定濾液的pH值。

1.3.4 色差測定

參考師萱等[13]的方法。對于脫腥后的各組海帶樣品，每組隨機挑選5 塊色澤均勻、表面平整的海帶（規格1 cm×1 cm），每塊海帶上隨機選擇3 個點，采用色差儀測定各點的L*、a*、b*值，并計算其色調值Hue=arctan（b*/a*）。以原料海帶為對照樣（CK），按式（1）計算脫腥后海帶樣品與對照樣間的總色差值（ΔE*），測定結果以15 個測量點的平均值表示。

1.3.5 葉綠素含量測定

參考Jeffrey等[14]的方法并稍作修改。準確稱取0.5 g打碎后的脫腥海帶裝入具塞試管中，向管內加入丙酮和無水乙醇按2∶1比例配成的浸提液，充分振蕩，定容至25 mL，室溫下避光浸提24 h。待浸提完畢后，用漏斗過濾浸提液，采用分光光度計測定濾液在645 nm和663 nm波長處的吸光度，根據公式（2）、（3）分別計算葉綠素a含量（Ca）和葉綠素b含量（Cb），并求得兩者含量之和：

式中：D為對應波長下的吸光度；V為葉綠素浸提液體積（25 mL）；W為加入海帶質量（0.5 g）。

1.3.6 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以酵母添加量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）作為自變量，為消除不同指標間的量綱差異，同時對感官評分與葉綠素a、b總含量指標進行離差標準化（min-max normalization，MMN）[15]，將兩者標準化后的數值分別乘以各自的權重系數（0.75和0.25，由學校和企業專家共同開會討論決定）后進行加和，其和值即為綜合評分（Y），綜合評分可作為模型的因變量（響應值），其最高分值為1 分。采用Box-Behnken設計3因素3水平的響應面試驗（表1），對試驗結果進行建模分析，以確定海帶發酵脫腥的最優工藝。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experimental design

1.3.7 整體材料吸附萃取-氣相色譜-質譜聯用（monolithic material sorptive extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，MMSE-GC-MS）測定

1.3.7.1 萃取條件

參照顧賽麒等[16]的方法并稍作修改。準確稱取2.0 g打碎后的脫腥海帶，將其加入20 mL棕色頂空瓶中。選取4 個MTRCC18吸附子（空心圓柱體形狀），以固定裝置串聯后置于頂空瓶內海帶正上方。將頂空瓶置于恒溫水浴鍋中，60 ℃萃取1 h。待萃取完畢后，取下所有吸附子迅速裝入熱脫附管，再由前處理平臺將熱脫附管轉移至熱脫附器中進行熱解吸進樣。

1.3.7.2 儀器參數

熱脫附器條件：不分流模式，初始溫度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。冷進樣系統參數：液氮制冷，起始溫度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留10 min。

GC條件：DB-5 MS毛細管柱（柱長60 m，內徑0.32 mm，膜厚1 μm），汽化室溫度240 ℃，不分流模式進樣。起始柱溫40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。載氣為99.999%高純氦氣，載氣流量1.0 mL/min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，全掃描模式，無溶劑延遲，質量掃描范圍m/z 35～500，掃描速率3.0 scans/s，燈絲發射電流200 μA，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測器溫度250 ℃，傳輸線溫度270 ℃，檢測器電壓1.2 kV。

1.3.7.3 定性方法[17]

將測定得到的揮發物質譜圖與NIST和Wiley（2008）標準譜庫進行比對，僅報道正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結果。同時計算各物質的線性保留指數（linear retention index，LRI）并與文獻中的LRI值進行比對，LRI計算見公式（4）：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分別表示待測揮發性成分、含n 個碳原子正構烷烴及含（n＋1）個碳原子正構烷烴的保留時間。

1.3.7.4 定量方法

將10 μL質量濃度為10 mg/L的內標物2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）加入到2 g海帶樣品中，通過計算待測揮發物與TMP峰面積的比值求得各揮發物的濃度（絕對校正因子設定為1），計算如式（5）所示：

式中：Ax、ATMP分別為待測揮發物與內標物TMP的峰面積；CTMP為加入TMP的質量濃度（10 mg/L）；VTMP為加入TMP的體積（10 μL）；mK為加入海帶樣品質量（2 g）。

1.3.7.5 氣味活性值分析

氣味活性值（odor activity value，OAV）反映各揮發物對樣品整體氣味輪廓的貢獻程度，計算見式（6）：

式中：Ci和OTi分別為揮發物i的含量/（ng/g）和氣味閾值/（ng/g）。OAV不小于1的化合物具有氣味活性，可定義為氣味活性物質[18]。

1.4 數據統計分析

采用SPSS Statistics 22.0和Design-Expert 8.0.5進行數據分析與處理，差異顯著性分析由單因素方差分析（Oneway ANOVA）法完成；采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵條件對海帶感官評分的影響

圖1 發酵條件對海帶感官評分的影響Fig. 1 Effect of fermentation conditions on sensory score of Laminaria japonica

由圖1A可知，隨著酵母添加量的增加，發酵后海帶樣品的感官評分呈先上升后下降的趨勢，當酵母添加量為0.15%時，感官評分達到最高，為70.4。段吳勇[9]結合電子鼻分析了不同酵母接種量對海帶腥味感官的影響，結果表明隨著酵母添加量增加，腥味逐漸減輕；當酵母添加量達到0.60×l08CFU/g時，脫腥效果最好；而當酵母添加量繼續增加，則會產生不良的發酵異味。本研究中，評價員從腥味脫除與異味生成兩方面對海帶樣品氣味進行綜合打分，分值高低反映了受評樣品氣味可接受度大小。隨著酵母添加量的升高，一方面海帶中的腥味物質可能會發生消降，另一方面新生成的異味物質也在不斷積累（如酵母菌固有氣味），當酵母添加量超過一定限值時（如大于0.15%），異味物質的生成速率可能超過腥味物質的消降速率，從而造成感官評分下降。綜上可知，酵母添加量選擇0.15%較佳。

由圖1B發現，發酵溫度在24～28 ℃范圍內，感官評分始終呈上升趨勢，28 ℃時達到最高（為70.4）；溫度繼續升高，感官評分有所下降但無顯著性差異，這與段吳勇[9]的研究結果基本一致，分析原因：在較低溫度（24～28 ℃）下，酵母增殖速率逐步增加，海帶原有的腥味物質可能通過生物轉化作用（合成反應或結構修飾）變成無腥味的物質，使得感官評分升高；當溫度繼續上升至30 ℃（酵母最適生長溫度）時，酵母增殖速率達到最大，菌體數量快速積累[19]，發酵異味（酵母味等）不斷加重，對海帶氣味產生不利影響，造成感官評分下降；發酵溫度超過30 ℃，酵母菌體活性將受到抑制，增殖速率減緩，脫腥效果下降。綜上所述，發酵溫度選擇28 ℃為宜。

由圖1C可知，在30～120 min范圍內，感官評分隨著發酵時間的延長而不斷增加（從49.0 分增至70.4 分），超過120 min，感官評分稍有下降但無顯著性差異，分析原因：當發酵時間未滿120 min時，隨著發酵時間的延長，酵母菌體處于不斷增殖過程，海帶中原有的腥味物質可能經生物轉化作用變為無腥味的物質，導致腥味物質不斷消降。隨著發酵時間繼續延長，菌體數量由于積累效應進一步增加（酵母味加重），且酵母進入穩定期之后可能生成新的次生代謝產物，造成海帶異味加重，導致感官評分下降。綜上，發酵時間選擇120 min較好。

2.2 發酵條件對海帶pH值的影響

圖2 發酵條件對海帶pH值的影響Fig. 2 Effect of fermentation conditions on pH value of Laminaria japonica

由圖2A可知，在0.05%～0.10%范圍內，pH值隨酵母添加量的增加而顯著下降；當酵母添加量超過0.10%時，pH值稍有下降但無顯著性差異。孔繁東等[20]通過實驗證實，與發酵溫度和發酵時間相比，酵母添加量對發酵液總酸含量影響最小。圖2B結果與圖2A類似，隨著發酵溫度的升高，發酵液pH值總體呈遞減趨勢；當發酵溫度為30 ℃時，pH值降至最小值（6.81）；在26～32 ℃范圍內，pH值無顯著性差異。分析原因：隨著發酵溫度的升高，酵母活性增加，呼吸作用增強，產生的CO2溶于水后形成碳酸，造成發酵液pH值下降。30 ℃為酵母最適生長溫度，此溫度下發酵液的pH值最低。由圖2C可知，pH值在30～150 min范圍內持續下降，從7.25降至6.75，推測可能與酵母發酵過程中產生的CO2持續溶于水并形成碳酸有關。對比圖2A、2B和2C可以發現，發酵時間對pH值的影響程度最大，顯著高于發酵溫度與酵母添加量，與孔繁東[20]和肖霄[21]等的研究結果相符。

在海帶發酵脫腥過程中，pH值變化不僅會影響酵母活性[22]，還會對海帶葉綠素含量造成影響：如葉綠素在酸性條件下結構會發生破壞（脫去鎂離子甚至完全分解），導致a*值升高，綠色消失，海帶色澤品質劣化。因此，有必要對海帶發酵過程中色差和葉綠素含量等指標的變化進行研究。

2.3 發酵條件對海帶色差的影響

由表2可知，不同條件下海帶L*、a*、b*、ΔE*和Δa*值呈上升趨勢，而Hue值呈下降趨勢。海帶中葉綠素含量較為豐富，故其色澤主要與a*值相關（a*正值代表紅色，負值代表綠色）。為了更直觀地反映發酵海帶與原料海帶間的a*值差異，計算Δa*值，Δa*值越大表示海帶綠色消降越嚴重，產品色澤越差。由表2可知，隨著酵母添加量的增大，Δa*值逐步升高；酵母添加量為0.15%時，Δa*值升至最大（0.18）；酵母添加量繼續升高，Δa*值保持不變。在24～28 ℃范圍內，Δa*值隨著發酵溫度的升高而不斷增加，超過28 ℃后增幅放緩，表明較高的發酵溫度會對海帶色澤產生不利影響。陳麗麗[23]研究了溫度對海帶色差的影響，發現在24 ℃時，Δa*值較小；當溫度升高到32 ℃時，Δa*值增至0.61，與本研究結果類似。除上述兩類因素外，發酵時間對海帶色澤也有重要影響。本研究中，在30～120 min范圍內，海帶樣品的Δa*值增幅較小，超過120 min后Δa*值急劇增加，分析原因：酵母發酵過程中不斷產生CO2，溶于水后生成碳酸，造成pH值持續下降。120 min之前可能發生葉綠素的脫鎂反應為主，生成脫鎂葉綠素（呈橄欖綠），導致Δa*值不斷升高；120 min以后脫鎂葉綠素結構可能進一步分解破壞，造成Δa*值急劇升高。將各發酵因素對海帶色差的影響程度進行排序：發酵時間＞發酵溫度＞酵母添加量。

表2 發酵條件對海帶色差的影響Table 2 Effect of fermentation conditions on color difference of Laminaria japonica

2.4 發酵條件對海帶葉綠素含量的影響

由表3可知，隨著酵母添加量的增加、發酵溫度的升高以及發酵時間的延長，無論是葉綠素a含量、葉綠素b含量還是兩者含量之和，均呈不斷下降趨勢，表明酵母發酵處理對海帶中的葉綠素具有明顯的破壞作用。為更直觀地反映各因素對葉綠素的影響，本研究基于葉綠素a和b的總消降率這一指標，對葉綠素的消降情況進行評價。在0.05%～0.20%范圍內，葉綠素a和b的總消降率隨著酵母添加量升高而顯著增大，當酵母添加量超過0.20%時，葉綠素a和b的總消降率略有增大但無顯著性差異。在24～32 ℃范圍內，葉綠素a和b的總消降率隨著發酵溫度的升高而顯著增大。潘柯伊等[11]指出：在20～40 ℃范圍內，海帶中的葉綠素對熱較為穩定。據此推斷，表3中出現的葉綠素含量隨溫度上升而下降的現象，可能源自酵母的分解作用，而非葉綠素自身的熱降解效應。在30～150 min范圍內，葉綠素a和b的總消降率隨著發酵時間的延長而顯著增大，這可能與酵母發酵過程不斷產生CO2有關：CO2溶于水形成碳酸，碳酸不斷積累，使得發酵液pH值持續下降（圖2C）。酸性條件下，葉綠素中的鎂離子可被氫離子置換出，變成脫鎂葉綠素（當pH值繼續降低時其結構甚至會完全破壞），從而導致海帶綠色消失，色澤品質劣化。葉綠素含量變化規律可與2.3節中色差變化趨勢一致。

表3 發酵條件對海帶葉綠素含量的影響Table 3 Effect of fermentation conditions on chlorophyll content of Laminaria japonica

表4 a*與葉綠素含量的相關性分析Table 4 Correlation analysis between a* and chlorophyll content

由表4可知，無論是酵母添加量、發酵溫度還是發酵時間，a*值與葉綠素含量間的相關系數均在0.7以上，表明兩者結果一致性較好。此外，a*值與葉綠素a含量間的相關系數超過0.9，顯著高于a*值與葉綠素b含量間的相關系數。分析原因：海帶中葉綠素主要以葉綠素a為主（約占80%～90%），且葉綠素a和葉綠素b兩者的呈色特性有所差異（前者呈藍綠色，后者呈黃綠色）。根據表4中相關系數大小，對各發酵因素進行排序，結果顯示：發酵時間＞發酵溫度＞酵母添加量，表明發酵時間對a*值與葉綠素含量的相關性影響最為顯著。

2.5 基于發酵后海帶樣品綜合評分的響應面試驗結果

2.5.1 響應面設計與建模分析

為進一步優化發酵條件，在上述實驗結果的基礎上，以酵母添加量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為自變量，發酵后海帶樣品的綜合評分為響應值（Y），采用Box-Behnken設計3因素3水平響應面試驗，結果見表5。利用Design-Expert 8.0.5軟件對表5中的數據進行分析，結果見表6。對表6中數據進行二次多項回歸擬合，即可建立各因素與響應值之間的二次多項回歸方程：Y=0.83＋0.05A-0.11B-0.24C＋1.22AB＋0.08AC＋0.03BC-0.17A2-0.25B2-0.15C2。

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 二次回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic regression model

由表6可知，所建二次回歸模型的P值為0.000 2小于0.001，表明模型非常顯著；失擬項P值為0.058 3大于0.05，表明模型失擬不顯著，與實際擬合較好。回歸模型的交互相AB（P=0.013 5）影響顯著，一次項B（發酵溫度，P=0.003 5）和C（發酵時間，P＜0.000 1）、二次項A2（P=0.002 0）、B2（P=0.000 2）和C2（P=0.005 0）影響極顯著，其他一次項（A酵母添加量）和交互項（AC和BC）影響不顯著，表明酵母添加量和發酵溫度兩因素間存在交互作用。此外，根據回歸模型各因素的系數絕對值A 0.05、B 0.11 和C 0.24，可知各因素對感官評分的影響程度依次是：C＞B＞A，即發酵時間＞發酵溫度＞酵母添加量。

2.5.2 兩因素交互作用結果

圖3 各因素交互作用對海帶綜合評分影響的等高線和響應面圖Fig. 3 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of different factors on sensory score of Laminaria japonica

由圖3a可知，酵母添加量與發酵溫度對綜合評分影響的交互作用顯著（P＜0.05）。如圖3b和3c所示，酵母添加量與發酵時間交互項、發酵溫度與發酵時間交互項，均對綜合評分的影響不顯著（P＞0.05），這與表6方差分析的結果相一致。

通過響應面法得到酵母脫腥的最優工藝條件為酵母添加量0.17%、發酵溫度27.96 ℃、發酵時間102.9 min，此條件下脫腥海帶的綜合評分Y最高，為0.92 分。

2.5.3 最優發酵工藝驗證實驗結果

考慮實際需要，對上述工藝條件進行調整，確定實際最優發酵工藝為：酵母添加量0.17%、發酵溫度28 ℃、發酵時間100 min。在此條件下進行3 次驗證實驗以考察模型的可靠性，結果表明：實際最優工藝條件下，發酵海帶感官評分為74.6 分，與原料海帶的感官評分（24.5 分）比較，感官評分增加204.49%；而葉綠素總量由原料海帶的3.83 mg/kg降至2.23 mg/kg，降低41.78%。綜上可知，本研究確定的實際最優發酵工藝效果良好。

2.6 脫腥前后海帶中的揮發性風味成分變化

采用MMSE-GC-MS法對脫腥前后的海帶樣品進行測定，共檢出7 大類43 種揮發性風味成分（表7），其中OAV不小于1的氣味活性物質有11 種，包括5 種直鏈醛（己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛）和1 種烯醛（2-壬烯醛）、2 種烯醇（1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇）、1 種酮類（2-庚酮）、1 種芳香類（聯苯）以及1 種雜環類（2-乙基呋喃）。采用優化后的發酵工藝：酵母添加量0.17%、發酵溫度28 ℃、發酵時間100 min，對海帶進行脫腥處理，結果顯示：無論是揮發物種類、總濃度還是OAV總和均顯著下降，具體而言，揮發物種類減少一半左右，從43 種降至23 種；揮發物總含量大幅下降，從287.65 ng/g降為151.92 ng/g；氣味活性物質減少3 種（2-辛烯-1-醇和2-庚酮被完全脫除，2-乙基呋喃喪失氣味活性）；OAV總和從91.75降至55.28，降幅接近40%。進一步分析表7可知，化合物自身結構特性可能對其脫除效果影響顯著，以OAV消降值排序：醛類（23.62）＞＞醇類（7.58）＞芳香類（2.43）；以OAV脫除率排序：酮類（90.70%）＞＞雜環類（62.44%）＞烴類（57.26%），但機理有待深入研究。

表7 MMSE-GC-MS法鑒定脫腥前后海帶中的揮發性成分Table 7 Volatile components identified by MMSE-GC-MS of Laminaria japonica before and after deodorization detection

續表7

醛類因其閾值較低，通常對海帶的整體氣味具有重要貢獻。由表7可知，脫腥前后海帶樣品中醛類物質總含量以及OAV總和均占所有化合物首位，檢出的11 種醛類均被相關文獻證實，表明醛類可能是表征海帶腥味的關鍵氣味物質。由表7可知，己醛是海帶中含量最高的醛類化合物（超過30 ng/g），與劉智禹等[28]的報道相符。高濃度的己醛可使海帶具有魚腥味、青草味等不良氣味[31]，經優化發酵工藝處理，海帶樣品中己醛含量顯著下降，OAV消降值也較高，達1.64。除己醛外，庚醛、辛醛和癸醛等直鏈醛的濃度在脫腥后也發生了顯著下降，其中庚醛和辛醛兩者氣味特征相似（同呈魚腥味），經脫腥后兩者OAV消降值分別為1.52和1.37（與己醛接近，占據醛類物質前列），表明它們可能在海帶脫腥過程中貢獻顯著。

醇類是海帶揮發性風味的重要組成。發酵后海帶樣品中醇類物質由5 種降為2 種，總含量由36.87 ng/g降為15.88 ng/g，OAV總和由16.34降到8.76（OAV消降值為7.58，脫除率接近50%）。段吳勇[9]經實驗證實：發酵后海帶樣品中所含的醇類物質種類大幅減少，濃度降低。據報道，1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇是海帶中主要的氣味物質[28]，后者呈典型的魚腥味和青草味，可能對海帶整體腥味貢獻顯著。本研究中，以優化工藝發酵后，海帶中兩種氣味活性醇類1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇OAV均顯著下降（OAV消降值分別為3.50和4.02，脫除率各自達25.87%和100%）。上述兩種烯醇結構十分相似（為同分異構體），但它們的氣味特征和脫除率卻相差較大，原因有待探明。

酮類也是海帶揮發性風味的組成成分。發酵后海帶樣品中酮類物質種類由9 種減少為3 種，總含量由47.84 ng/g降為9.13 ng/g，OAV總和由1.72降到0.16。雖然酮類的OAV脫除率極高（90.70%），但其OAV總和較小，故對海帶整體氣味影響不大。2-庚酮是酮類中唯一的氣味活性物質，經發酵后完全被脫除。1-辛烯-3-酮是含量最高的酮類化合物（14.76 ng/g），呈魚腥味，對海帶腥味具有一定貢獻，以優化工藝發酵后，海帶樣品中1-辛烯-3-酮的脫除率為100%，與段吳勇[9]的研究結果類似。

芳香類和烴類由于自身氣味閾值普遍偏低，故可能對海帶揮發性風味貢獻較小。由表7可知，從原料海帶中分別檢出了9 種芳香類和5 種烴類物質，總含量分別為67.06 ng/g和26.15 ng/g。除聯苯外，所有芳香類和烴類物質的OAV均小于1，表明其對海帶整體腥味貢獻較小。值得注意的是，脫腥前后海帶樣品中聯苯的OAV始終保持較高水平（分別為6.74和4.74），推測原因：聯苯為海洋環境污染物，通過生物富集作用在海帶中富集，且采用酵母發酵法難以脫除聯苯。

2-乙基呋喃是海帶的氣味活性物質之一，屬環氧雜環類化合物，呈辛辣的橡膠味。采用優化工藝發酵后，海帶中該物質的OAV已降至1以下（0.77），表明其氣味活性已喪失。二碘甲烷是原料海帶中被唯一檢出的含碘揮發物，有特殊的刺激味，在發酵后的海帶樣品中未被檢出，脫除率達100%。

3 結 論

通過酵母發酵工藝對海帶進行脫腥處理，綜合考察了酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、發酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）和發酵時間（30、60、90、120、150 min）3 個因素對海帶感官評分、pH值、色差、葉綠素含量的影響，結果表明發酵時間對海帶樣品的感官評分和色澤品質影響最大，發酵溫度次之，酵母添加量最小。運用Box-Behnken 3因素3水平的響應面試驗設計，將感官評分與葉綠素總量兩項指標進行離差標準化后再加權求和，計算其綜合評分作為模型響應值，確定了海帶發酵的實際最優工藝：酵母添加量0.17%、發酵溫度28 ℃、發酵時間100 min。該工藝下發酵海帶感官評分為74.6 分，原料海帶為24.5 分（增幅達204.49%），葉綠素總量為2.23 mg/kg，原料海帶為3.83 mg/kg（降幅為41.78%），發酵效果總體良好。采用MMSE-GC-MS法分析了發酵前后海帶樣品中的揮發性風味成分，共檢出7 大類43 種揮發物，確定己醛等11 種氣味活性物質（OAV≥1）。與原料海帶相比，發酵后海帶中揮發物種類從43 種降至23 種，揮發物總含量與OAV總和分別下降135.73 ng/g和36.47，降幅分別為47.19%和39.75%，脫腥效果顯著。化合物自身結構特性可能對其脫除效果影響顯著，發酵海帶樣品中醛類的OAV消降值最大（23.62），而酮類的消降率最高（90.70%），原因有待后續深入探討。