二維相關可見-近紅外光譜結合支持向量機評價豬肉新鮮度

王文秀，彭彥昆*，孫宏偉，魏文松，鄭曉春

（中國農業大學工學院，國家農產品加工技術裝備研發分中心，北京 100083）

生鮮肉作為蛋白質的主要來源，在人們的日常飲食結構中占據非常重要的地位。2016年我國肉品的總產量達8 625萬 t，整個肉品行業發展潛力巨大。然而，由于肉品本身富含營養物質和水分，容易被其他微生物入侵而發生系列變化，導致肉的腐敗變質，給消費者的健康安全造成威脅。因此，對肉的新鮮度進行快速評價具有非常重要的現實意義。

可見-近紅外光譜技術具有無損傷、操作簡單、無需樣品前處理的優點，已被證實可以對生鮮肉的品質安全參數進行快速分析[1-4]。目前，基于光譜技術對肉品新鮮度評價可以參照GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產品》預測揮發性鹽基氮值（total volatile basic nitrogen，TVB-N）評價新鮮度。也可借助化學計量學方法，直接將光譜信息與新鮮度建立聯系作出評價。馬世榜等[5]利用近紅外光譜結合支持向量機（support vector machine，SVM）對牛肉的新鮮度進行定性判別，驗證集正確率為88.89%。蔡健榮等[6]利用近紅外光譜對豬肉中TVB-N進行定量分析，預測集相關系數為0.823 8。然而，由于近紅外光譜數據量大，光譜信息復雜且具有多重共線性，因此不少學者展開特征波長篩選的研究。如馬世榜[7]、劉飛[8]等利用無信息變量消除和連續投影算法提取有效變量，建立了更為簡化的TVB-N預測模型。這些方法大多通過多次采樣分析，構建多個子模型，通過評價模型誤差確定最優變量組合。然而，不同方法篩選的變量個數和分布常常有所不同，部分變量缺乏化學意義上的響應機理解釋，因此變量優選仍是目前近紅外光譜分析面臨的重要問題。

二維相關光譜通過將光譜信號擴展到第二維上，可以使原來一維光譜上的弱峰和重疊峰更加清晰，從而提高光譜分辨率。同時，通過添加一定的外界擾動，對動態光譜進行二維相關計算，可以解析光譜細微特征的變化，尋找與微擾相關的敏感變量[9-11]。目前，已有學者將二維相關光譜應用在牛奶摻雜鑒別[12]、食用油摻雜檢測[13]、中藥摻偽[14]、蛋白飼料原料判別[15]、紅棗營養成分變化解析[16]等的研究上，表明通過分析二維相關光譜特性，可以觀察到各吸收峰隨外部擾動的變化關系以及對外部擾動的敏感程度。結合本實驗的研究，將所有樣品（從新鮮到腐敗）整體作為待研究體系，以TVB-N為外部擾動，原始光譜可看作是外擾誘發的動態光譜。通過二維光譜計算，解析同步光譜，觀察外部擾動對不同波長下動態光譜的影響，可以從機理上確立與外部擾動相關的敏感波長。目前將二維相關近紅外光譜應用在生鮮肉新鮮度評價的研究尚鮮見報道。

為探究二維相關光譜優選新鮮度特征變量的可行性，本研究以生鮮豬肉中TVB-N為外界干擾對光譜進行調制，通過研究在外部擾動存在下體系的變化，解析二維相關同步光譜和自相關譜，分析隨外部擾動變化的光譜特征信息，確定與TVB-N相關的特征變量，建立生鮮豬肉的快速判別模型。

1 材料與方法

1.1 材料

冷鮮豬肉背最長肌購買于北京美廉美超市。將其修整為長×寬×高約8 cm×5 cm×2.5 cm的肉塊，放置在自封袋中運輸至無損檢測實驗室。將所有樣品按順序編號后無積壓放置在4 ℃冰箱中保存，每12 h取出2 個樣品進行光譜采集和理化值測定，共進行15 d，獲得有效樣品58 個。

1.2 儀器及光譜采集

自行搭建的實驗用可見-近紅外光譜采集系統主要包括鹵鎢燈光源、AvaSpec-2048光譜儀（荷蘭Avantes公司）、光纖、環形光導、計算機等硬件。光譜范圍為350～1 100 nm，分辨率為0.59 nm。采集光譜前，將儀器預熱約30 min，然后依次采集參比光譜、暗背景光譜以實現校正，最后采集樣品的光譜信息。整個實驗過程中，保證光纖探頭與待測物距離一致，每個樣品采集5 個不同位置處光譜信息并求取平均值，從而減少實驗誤差。光譜數據的獲取和保存通過光譜儀配套軟件Avasoft完成。

1.3 理化指標測定

光譜信息采集完成后，參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的方法對豬肉樣品中的TVB-N進行測定，并參照文獻[17]將TVB-N小于15 mg/100 g的樣品定義為新鮮肉，將TVB-N介于15～25 mg/100 g之間的樣品定義為次新鮮肉，將TVB-N大于25 mg/100 g的樣品定義為腐敗肉，以此為標準對豬肉的新鮮度進行劃分。

1.4 數據處理與分析

首先基于全波段光譜信息建立豬肉新鮮度的判別模型。由于近紅外光譜采集過程中常常伴隨基線漂移、雜散光等噪音信號，因此本研究采用標準正態變量變換（standard normal variate，SNV）、歸一化的預處理方法來減少干擾信息，并進行分析比較。建模采用了SVM判別分析方法，該方法以結構風險最小化為準則構造決策超平面，使不同種類樣品的間隔最大[18]。

以TVB-N為外部微擾，進行二維相關同步光譜解析，尋找與新鮮度評價相關的特征變量。第1步：根據TVB-N實測值，從最小值和最大值之間以均勻濃度梯度共選取10 個代表性樣品用于二維相關光譜分析。第2步：提取光譜特征，本研究采用包絡線去除方法來擴大較弱的特性信息，同時壓抑背景光譜[19]。第3步：根據包絡線去除后的光譜，選擇不同TVB-N對應光譜具有明顯差異的敏感波段。第4步：對上述敏感波段分別進行二維相關同步光譜分析，獲取其二維同步光譜及自相關譜。第5步：通過解析同步譜和自相關譜，明確與TVB-N變化密切相關的特征波長。

基于所選的特征波長，分別從原始、經SNV預處理、歸一化預處理后的光譜中提取相應的光譜數據組成新的光譜矩陣，建立優化的判別模型。整個數據分析流程圖如圖1所示。上述預處理和建模過程在Matlab 2012a平臺下利用PLS-Toolbox完成，二維光譜解析在薩斯喀徹溫大學加拿大光源編寫的MIDAS軟件下完成。

圖1 數據分析流程圖Fig. 1 Flow chart of data analysis

2 結果與分析

2.1 新鮮度統計結果

根據測定的TVB-N對58 個豬肉樣品的新鮮度進行統計分析，共有14 個新鮮肉、34 個次新鮮肉以及10 個腐敗肉。將所有樣品按照3∶1的比例分為校正集和驗證集，校正集有43 個樣品，驗證集有15 個樣品。將3 類樣品分別賦值為1、2、3，各子集樣品的新鮮度情況如表1所示。

表1 3 種新鮮度豬肉的類別賦值及其在校正集和驗證集中分布Table 1 Category assignment of three kinds of pork and their distribution in calibration and prediction set

2.2 一維可見-近紅外光譜分析

由于原始光譜信息兩端噪音較大，信噪比低，因此只截取400～1 000 nm波段范圍內的光譜用于后續定性判別分析。從新鮮、次新鮮和腐敗豬肉中各取一個樣品進行光譜信息的對比分析，其原始一維近紅外光譜如圖2a所示，3 類樣品整體上趨勢一致，在545～585 nm之間具有明顯差異，該波段范圍與肉中色素的變化有關[20]。經過SNV和歸一化預處理后的光譜曲線如圖2b和c所示，2 種預處理方法均能有效消除基線漂移、光散射等噪音信號，提高光譜分辨率和靈敏度。

圖2 樣品光譜曲線Fig. 2 Spectral curves of samples

2.3 二維相關同步光譜分析

為尋找能對豬肉新鮮度快速評價的關鍵變量，以TVB-N為外部微擾條件，選擇10 條代表性光譜并進行包絡線去除，以增強對TVB-N變化敏感波段的光譜特征，同時也增強每條曲線上各個波段之間光譜信息的對比性。包絡線去除前后的光譜曲線對比如圖3所示，經過包絡線去除后光譜集中在0～1之間，且在460、590 nm及960 nm波長處出現明顯的波谷，可見光波段范圍內的波谷與肉中肌紅蛋白的濃度和狀態有關，960 nm波長處與N—H鍵的二級倍頻有關。在進行二維相關光譜分析之前，為盡可能詳盡的挖掘有效變量，避免微弱的特征信息被隱藏，結合包絡線去除后的光譜曲線，將不同TVB-N光譜曲線之間具有差異的波段細分為7 個子區間，分別進行二維同步光譜解析。這7 個子區間分別為400.1～429.4、430.6～494.8、496.0～550.4、555.1～584.0、585.7～680.3、835.9～954.7、955.8～999.5 nm。

圖3 代表性光譜包絡線去除前后對比圖Fig. 3 Comparison of representative spectra before and after continuum removal

對7 個子區間分別進行二維光譜分析，其三維投影圖和自相關譜圖分別如圖4、5所示。三維立體圖形的X軸和Y軸為獨立的變量軸，一般為波長或波數，本研究中的變量為波長；Z軸為因變量軸，本研究中以相關強度為Z軸構成三維投影圖[21]。同步譜反映了動態光譜信號隨外部擾動發生變化的協同程度，它關于主對角線對稱分布，可以從三維同步圖中直觀地觀察到自相關峰的位置、強度。自相關峰位于主對角線上，它的強度反映了該變量處光譜信號隨外部擾動變化的程度[22-28]。結合自相關譜圖，在波峰位置處相關強度大，表明該變量處光譜信號對微擾較敏感，即為所要尋找的與新鮮度密切相關的特征信息。

結合圖4a、5a，在400.1～429.4 nm波長范圍內，主對角線上411 nm和428 nm波長處出現微弱的自相關峰，表明這兩個波長下的光譜信號對外部微擾敏感，與TVB-N的變化有一定的關系。根據Benesch等[29]的研究，415 nm為氧合血紅蛋白的吸收峰，430 nm為脫氧血紅蛋白的吸收峰，本研究中的波長位置與之稍有偏移，這可能與所用光譜儀器的響應有關。結合圖4b、5b，在430.6～494.8 nm波長范圍內，434、461 nm和490 nm波長處出現自相關峰，434 nm為脫氧肌紅蛋白的吸收峰，該處的相關強度高于461 nm和490 nm，從三維投影圖的顏色參考圖中也可以直觀地看出。結合圖4c、5c，在496.0～550.4 nm波段范圍內，508、521 nm和537 nm波長處出現自相關峰，且537 nm處的強度高于前二者，表明該位置處對應的官能團隨TVB-N變化更加明顯。根據Liu Yang等[30]的研究，505 nm為高鐵肌紅蛋白的吸收峰，535 nm為氧合肌紅蛋白的吸收峰，本研究的特征變量雖稍有偏移，但仍可將其歸屬為二者的吸收峰。結合圖4d、5d，在555.1～584.0 nm波段范圍內，560、569 nm和580 nm處出現自相關峰，其中580 nm處的強度最高。參考Mancini等[20]研究可知，530～580 nm波段范圍為肌紅蛋白色素的特征波段。結合圖4e、5e，在585.7～680.3 nm波段范圍內，595 nm波長處出現較強的自相關峰，在620、630 nm和667 nm波長處出現3 個相對弱的自相關峰。其中，630 nm為硫化肌紅蛋白的吸收峰，這是由于肉在放置過程中細菌產生的H2S氣體與肌紅蛋白結合，形成了硫化肌紅蛋白。結合圖4f、5f，在835.9～954.7 nm波段范圍內，937 nm波長處出現一個較強的自相關峰，其與C—H鍵的三級倍頻有關。結合圖4g、5g，在955.8～999.5 nm波段范圍內，977 nm波長處出現較弱的自相關峰，與O—H鍵的一級倍頻有關。

圖4 不同波段范圍內豬肉樣品的二維相關同步光譜Fig. 4 2D-correlation spectra of pork samples in different spectral regions

圖5 不同波段范圍內的自相關譜Fig. 5 Autocorrelation spectra in different spectral regions

綜合各個波段，可以發現通過解析二維相關同步光譜，得到的17 個特征變量多集中在可見波段。這與肉在貯藏放置過程中，由于微生物繁殖產生氫過氧化物，引起肉中色素發生變化有關。同時，由于厭氧菌分解蛋白質和氨基酸等產生吲哚、甲胺和H2S等物質，脂肪氧化形成硫代巴比妥酸等物質，這些均會促進肌紅蛋白的轉化和血紅素的氧化[31]。

2.4 定性判別分析模型建立

表2 基于全波段光譜的SVM判別分析模型結果Table 2 Discrimination results of SVM models based on full-band spectra

首先，基于全波段光譜數據建立豬肉新鮮度的SVM判別模型，并比較原始、經SNV預處理和歸一化預處理光譜的建模效果，如表2所示?？梢娀谶@3 類光譜信息，在校正集中分別有6、4、5 個樣品誤判，驗證集中均有1 個樣品誤判，且均為腐敗樣品被誤判，總體判別正確率為87.93%、91.38%和89.66%，同時也可看出預處理對模型的效果有所改善，預測總體正確率有所提高。

然后，利用解析二維相關光譜得到的17 個特征變量，建立優化的判別分析模型?；谒x特征波長，利用原始光譜信息建立的SVM模型，校正集中次新鮮樣品全部判斷正確，新鮮和腐敗樣品各有1和2 個誤判，驗證集樣品全部判斷正確，總體判別正確率為94.83%。利用SNV預處理后光譜建立的SVM模型，校正集中新鮮和次新鮮樣品全部判斷正確，腐敗樣品有1 個誤判，驗證集樣品全部判斷正確，總體判別正確率為98.28%。利用歸一化預處理后光譜信息建立的模型效果與SNV預處理后建模效果一致，總體判別正確率為98.28%，其校正集和驗證集樣品判別結果如圖6所示，可見除第40號腐敗樣品被誤判為次新鮮外，其余樣品均判斷正確。同時也進一步驗證了光譜的預處理有助于改善模型，提高模型預測效果。優化后的判別模型，僅利用了總體變量1.61%（原始變量個數為1 059）的特征變量，取得了更佳的模型結果。這表明通過二維同步光譜分析選出的17 個變量，能夠反映與豬肉新鮮度密切相關的特征信息，表征不同TVB-N的光譜變化，簡化判別模型，縮短運算處理時間。

圖6 基于歸一化預處理光譜特征變量的判別模型結果Fig. 6 Discrimination results using feature variables based on spectra after normalization

3 結 論

以TVB-N為外界干擾，通過解析二維相關同步光譜和自相關譜，共提取到17 個與新鮮度有關的特征變量?；谠肌NV預處理及歸一化預處理后的光譜，利用特征波長對應光譜建立的SVM模型效果優于全波段光譜，總體判別正確率為94.83%、98.28%和98.28%。同時也說明，光譜的預處理有助于改進模型效果。可見-近紅外光譜結合二維相關分析，可以有效的解析肉在腐敗變質過程中的光譜特征信息變化，確定與新鮮度相關的敏感變量。該方法簡單快速，為近紅外光譜特征變量篩選提供了一種新的方法。二維相關光譜包含信息豐富，選擇的外擾不同得到的譜圖不同，可進一步借助化學計量學方法，對各官能團的變化進行有效解析，提取特征光譜信息。