綜合設計性實驗在病理生理學教學中的實踐與評價
——觀察限制性液體復蘇對休克腸I/R損傷的保護作用

袁文丹，李小辰，張 穎，馬 月，毛慧琳，楊程程

（濱州醫學院，山東 煙臺 264003）

學生綜合設計性實驗是對傳統的實驗進行的一項教學改革，是依托機能學開放實驗室開設的綜合設計性實驗。本綜合設計性實驗的創新點是在原來病理生理學家兔休克實驗的基礎上設計的，觀察限制性液體復蘇對失血性休克腸缺血再灌注（I/R）的影響及治療作用。本綜合設計性實驗訓練了學生綜合運用知識的能力，并探討腸I/R復蘇治療的作用及預后，提高了學生發現問題、分析問題、解決問題的能力。

1 實驗的思路和方法

1.1 學生自主設計實驗方案

實驗教師提前1~2周給出實驗目的，講解實驗的有關要求，進行分組；學生通過上網查閱大量文獻自行設計實驗方案[1]，內容包括實驗目的和原理、所需的動物和器材、主要的實驗步驟和方法、預期的結果等。學生在課堂上對獲得的知識加以概括、分析、綜合，經小組內部討論后參與班上的討論，確定實驗方案。如學生自主設計方案之一：“研究限制性液體復蘇方式對失血性休克腸I/R的影響，并評價效果、估計預后。”該實驗的創新點之一是：探討不同液體復蘇方式對腸I/R損傷的影響及可能導致多系統器官功能障礙（MODS）的機制。本實驗創新點之二是：學生針對腸I/R損傷，科學合理地設計觀察指標，如觀察自由基脂質過氧化損傷產生的腸丙二醛（MDA）含量、血漿中MDA含量、堿剩余（BE）及內毒素（LPS）水平，為腸I/R損傷機制研究及預后提供了實驗依據。

1.1.1 實驗目的和原理 休克后腸黏膜I/R損傷是導致MODS的重要基礎和中心環節，因此減少腸黏膜I/R損傷是減少全身炎癥反應（SIRS）的發生及阻止休克轉化為MODS的關鍵。本實驗通過建立失血性休克動物模型，觀察不同液體復蘇狀態下小腸黏膜I/R損傷程度，檢測腸組織MDA含量、血漿中MDA含量、堿剩余及內毒素水平的變化，探討復蘇治療作用及估計預后，為臨床實踐提供進一步的理論和實驗依據。

1.1.2 實驗方法和步驟 方法：家兔24只，隨機分為假休克組、限制補液組、常規補液組、休克未治療組，每組6只。假休克組動物僅穿刺頸動脈、頸靜脈，給予插管但不放血。其他3組動物進行頸動、靜脈插管，連接血壓記錄儀，然后從頸動脈放血，使血壓降至40~50 mmHg，接著根據血壓的變化放出或回輸少量血液，使血壓繼續維持在40~50 mmHg之間，并且觀察30分鐘。在制作休克模型成功后，限制補液組、常規補液組分別經頸靜脈輸入林格氏液，血壓分別維持在60~70 mmHg和90~120 mmHg；而休克未治療組不輸入任何液體。在治療60分鐘后，除假休克組外，均用乳酸林格氏液與抗凝的全血按2∶1的體積比進行充分復蘇，并繼續維持大鼠血壓在休克前水平，持續60分鐘。4組均于治療開始的0分鐘、60分鐘、120分鐘分別取腸系膜上靜脈血1 ml，然后測定血漿MDA、BE、LPS含量，并于實驗120分鐘時處死動物，無菌操作下開腹，距回腸瓣5 cm處取回腸4 cm，生理鹽水洗凈，組織勻漿，測定腸組織MDA含量。另外，腸組織用10%甲醛固定，常規取材制片，HE以及PAS染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2 學生獨立完成實驗

本實驗方案在教師指導下，教師和學生一起對其科學性、創新性、可行性進行了討論，實驗由學生獨立完成，既培養了嚴謹求實的學風，又培養了學生的動手能力和創新能力。

1.2.2 實驗結果（部分結果如下）（1）失血性休克時，缺血再灌注損傷導致腸黏膜損傷加重，液體復蘇后家兔血漿中及腸道組織勻漿中MDA水平升高，血BE負值增大，LPS含量增加，說明腸道組織發生脂質過氧化損傷及酸中毒損傷，與常規補液組比較，限制補液組能顯著改善上述改變（P<0.05），見表1。

表1 不同液體復蘇方式治療60分鐘時血漿MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

表1 不同液體復蘇方式治療60分鐘時血漿MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

注：與假休克組、休克未治療組比較，*P<0.05；與常規補液組比較，#P<0.05

組別假休克組限制補液組常規補液組休克未治療組LPS（EU/mL）0.178±0.028 0.467±0.066#0.788±0.076*1.535±0.123血壓（mmHg）90~120 60~70 90~120 45~55 MDA（nmol/L）13.07±0.32 12.03±0.61#15.40±0.54*24.07±0.92 BE（mmol/L）-0.41±2.53-1.41±2.19#-3.41±3.21*-5.41±3.35

（2）光鏡下見：假休克組小腸絨毛結構正常；休克未治療組小腸絨毛結構嚴重破壞，局部組織壞死脫落，黏膜厚度及絨毛高度明顯降低，黏膜下層血管擴張充血、大量炎性細胞浸潤；常規補液組及限制補液組均可見小腸絨毛結構基本正常，小腸部分絨毛及黏膜下層疏松水腫，炎性細胞浸潤，有少量滲出物，與常規補液組比較，限制補液組小腸黏膜厚度及絨毛高度變化較小（P<0.05），見表 2。

1.3 實驗討論

通過實驗，使學生掌握了科研設計的基本原則和科研工作的基本思路。失血性休克是創傷及外科手術中較常見的合并癥，腸道是失血性休克后損傷的重要靶器官，腸道可發生細菌易位[2]。易位的細菌產生大量的內毒素（LPS）并釋放至血液，發生內毒素血癥，并激活炎癥細胞，進一步加劇炎癥反應，因此腸道又是SIRS（全身炎癥反應綜合征）的啟動器官。近年來，腸I/R損傷發生及防治措施的研究越來越受到重視，但其發生機制目前尚不完全清楚。在本實驗中，小腸黏膜承受失血性休克低灌注、缺氧產生酸中毒及輸液后腸I/R三重損傷，可導致腸黏膜通透性增加、屏障破壞、自由基損傷，不僅如此，休克時腸道屏障功能下降，腸道炎癥反應在休克復蘇后仍可持續存在，也是發生MODS的重要原因。而休克復蘇過程治療不當在一定程度上加重I/R損傷。已有大量證據表明，氧自由基損傷是早期缺血再灌注損傷的重要機制[3]。因此，休克發生后，減少腸黏膜缺血再灌注導致的氧自由基損傷，保護腸黏膜屏障是減少SIRS發生及阻止休克患者轉化為MODS的關鍵。本實驗結果顯示，限制性液體復蘇治療可減少氧自由基、內毒素的產生及減輕黏膜屏障的損傷程度。本實驗探討了不同治療措施與繼發SIRS及MODS之間的關系，為減少失血性休克MODS發生及預后提供一定的理論和實驗依據。

表2 不同液體復蘇治療120分鐘時腸道黏膜損傷情況（±s）

表2 不同液體復蘇治療120分鐘時腸道黏膜損傷情況（±s）

注：與假休克組、休克未治療組比較，*P<0.05；與常規補液組比較，#P<0.05

組別假休克組限制補液組常規補液組休克未治療組絨毛高度（μm）412.4±10.7 338.6±11.4#230.2±17.1*138.3±11.3血壓（mmHg）90~120 90~120 90~120 90~120腸 MDA（nmol/mg）0.833±0.112 2.682±0.176#4.553±0.526*7.029±0.271黏膜厚度（μm）515.7±13.5 461.5±10.7#420.1±12.3*326.2±15.5

2 學生自主實驗設計的效果評價和體會

（1）通過開設創新性的綜合設計性實驗，加強了學生對理論知識的學習、理解和記憶，使學生對病理生理學理論和實驗課產生了濃厚的興趣，對課堂上所學的休克、酸堿紊亂、缺血再灌注的機理及對機體的相互影響有了更深入具體的研究，并使學生掌握了通過網絡查閱相關知識的技能，提高了發現問題、分析問題、解決問題的能力，由被動上課轉為了主動學習[4]。

（2）對教師的實驗教學能力提出了新的挑戰。學生的綜合設計性實驗要求教師不斷更新知識結構，探索和幫助學生完善實驗方案，引導學生正確進行實驗操作，順利完成實驗報告的撰寫與答辯。

（3）提高了學習興趣，為學生終身學習奠定了基礎。通過實驗，使學生經歷了一次初步進行科學研究的實踐，使之在大學時代就能感悟到科學研究的嚴謹與艱苦，不僅磨煉了意志、發散了思維，還提高了其學習積極性和主動性，為學生今后從事臨床工作及科學研究工作奠定了良好的基礎。