丹參素鈉大孔樹脂吸附分離過程的近紅外在線監測研究＊

馬晉芳，畢昌瓊，歐邦露，肖 雪，王雪利，葛發歡＊＊

（1.中山大學藥學院 廣州 510006；2.中山大學南沙研究院 廣州5 11458；3.貴州景峰注射劑有限公司 貴陽 550018；4.廣東藥科大學 廣州 510006；5.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術研究中心 廣州 510006）

丹參為傳統名貴中藥，是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，味苦，性微寒，歸心、肝二經，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰的功效[1]。參芎葡萄糖注射液是由丹參、鹽酸川芎嗪經過現代工藝制造的一種用于閉塞性腦血管疾病及其他缺血性血管疾病的現代復方制劑[2-4]。丹參中的水溶性酚酸類成分主要有丹參素、丹酚酸B等。現代藥理研究表明，丹參酚酸類成分具有改善循環、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脈流量及心肌供氧量等作用，是丹參祛瘀、活血的主要活性成分[5-6]。

參芎葡萄糖注射液中，丹參其經過復雜的生產工藝制備得到以丹參素為主要成分的提取物。因此，為了保證該產品質量的穩定性和均一性，同時為了節約企業成本，需要對生產過程進行質量控制，但目前實際生產過程中的質量控制缺乏在線監測手段，無法及時地對有效成分含量做出分析。由于近紅外光譜（NIR）是近年來發展迅速且應用廣泛的一種分析技術，且具有分析方便快速，綠色環保，可多成分同時在線檢測等優點[7]。

本研究采用近紅外光譜分析技術結合化學計量學，對丹參大孔樹脂吸附分離過程中的丹參素鈉含量進行定量分析，并在線監測大孔樹脂吸附分離過程中丹參素鈉含量的變化，為參芎葡萄糖注射液大生產過程中大孔樹脂吸附分離單元的在線質量控制奠定基礎。

圖1 丹參素鈉大孔樹脂吸附分離階段在線近紅外原始光譜

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS205 DuaLRange型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度計（島津（中國）有限公司）；Matrix-F近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；化學計量學分析系統（THUNIR V3.0（Demo），清華大學），在線監測分析系統（THU NIR Online（Demo），清華大學）；中小型提取罐（30 L）。乙腈（色譜級，德國默克），甲酸（分析級，廣州化學試劑廠）；丹酚酸B標準品（批號：111562-201514，中國食品藥品檢定研究院）；丹參素鈉標準品（批號：110855-201412，中國食品藥品檢定研究院）；丹參提取液、丹參柱層析液（實驗室中試生產線制備）。

1.2 收集樣品

丹參藥材300 kg，經實驗室中試生產線制備得到的丹參素鈉提取物，經大孔樹脂上樣吸附后，用6 BV純化水進行沖洗，流速均為6 BV/h，從開始收集水洗液的同時，每隔1 min采樣一次，過0.45 μm微孔濾膜，置于密封容器中存放（共制備五批樣本）。

1.3 丹參素鈉的含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流動相體系：乙腈（A相）-0.4%甲酸水溶液（B相）；梯度洗脫，0～18 min，7%～14%A，流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長：280 nm，檢測器：DAD檢測器，進樣量10 μL。

1.3.2 溶液的配制

精密稱取丹參素鈉標準品7.02 mg于10 mL容量瓶中，加適量水溶解并定容至刻度，搖勻，作為丹參素鈉對照品溶液。收集大孔樹脂工藝水洗液樣品，作為供試品溶液。

1.3.3 測定方法

分別對照品溶液和供試品溶液，經HPLC測定其中丹參素鈉的含量。

1.4 NIR光譜的采集[8-9]

大孔樹脂吸附分離過程中，采用透射在線采集，以空氣為背景，光程2 mm，掃描范圍800～2 500 nm，分辨率2 nm，掃描次數32次，每個采樣點重復掃描3次，求平均光譜，采集的近紅外原始光譜圖如圖1所示。

1.5 數據處理與軟件

根據THU NIR Online（Demo）[10]在線監測分析系統對大孔樹脂工藝過程終點的判定和吸附分離過程的趨勢的判斷，選擇符合生產條件的樣本。

采用THUNIR V3.0（Demo）化學計量學分析系統，結合馬氏距離圖對樣品中存在的異常點進行剔除，確定建模所用的校正集、外部驗證集及在線驗證集。然后在此基礎上對原始光譜進行光譜預處理，并選擇建模的光譜區間，結合偏最小二乘法對樣本的光譜與其性質的相應含量值建立定量校正模型。

通過驗證模型預測值的精度和可信度，進而判斷模型的優劣以及擬合程度，也稱為模型精度的評價[11-12]，模型精度高，證明該模型具有實際應用價值，對未知樣本的預測才具有意義。

2 結果與分析

2.1 標準方法的測定值

高效液相色譜法建立丹參素鈉標準曲線，方程為Y=7.5479X-0.0825，R2=0.9999，線性范圍在 0.0035～1.4040 mg·mL-1。作為校正集批次1～3的丹參素鈉質量濃度范圍在0.0009～1.1740 mg·mL-1，作為外部驗證集批次4的丹參素鈉質量濃度范圍在0.0011～1.0245 mg·mL-1，作為在線驗證集批次5的丹參素鈉質量濃度范圍在0.0011～0.8650 mg·mL-1。結果表明外部驗證集和在線驗證集的丹參素鈉質量濃度均落在校正集范圍內，具體測定結果見表1～3。

2.2 近紅外定量校正模型的建立

2.2.1 在線監測軟件分析大孔樹脂吸附分離階段

采用THU NIR Online（Demo）軟件對丹參大孔樹脂吸附分離過程中的各批次進行分析比較[21]，光譜波長選擇為800-2500 nm，排除噪聲干擾，根據在線監測分析的結果檢測目標成分的變化情況，如圖2所示從左向右，曲線趨勢逐漸趨于平衡，提示達到柱層析終點。通過比較各個批次，選擇提取過程趨勢一致的五個批次進行模型的建立與預測分析。

表1 校正集樣本中丹參素鈉含量測定結果表

續表1

表2 外部驗證集中丹參素鈉的含量測定結果表

2.2.2 建模方法的選擇[13-15]

近紅外光譜分析技術中，常用的線性校正方法有多元線性回歸（MLR）法、主成分回歸（PCR）法、偏最小二乘（PLS）法。

多元線性回歸（MLR）法又稱為逆最小二乘法，該方法計算簡單，但由于光譜變量之間往往存在共線性問題，無法求光譜陣的逆矩陣或求取的逆矩陣不穩定，從而在很大程度上降低了所建模型的預測能力，使MLR方法在近紅外光譜分析中的應用受到了很大限制。

表3 在線驗證集中丹參素鈉的含量測定結果表

主成分回歸（PCR）法是采用多元統計中的主成分分析（PCA）法，先對近紅外光譜矩陣進行分解，然后選取主成分得分來進行多元線性回歸運算，得到定量模型。但PCR中，只對光譜陣進行分解，消除無用的噪聲信息。

偏最小二乘（PLS）法是把矩陣分解和回歸并為一步，即對光譜陣和濃度陣分解的同時，將濃度陣的信息引入到光譜矩分解過程中，在每計算一個新主成分前，將光譜陣的得分與濃度陣的得分進行交換，使得光譜陣主成分直接與濃度關聯。這樣可以克服PCR只對光譜陣進行分解的缺點，且PLS建立的模型預測能力與穩定性良好，噪音去除明顯，并能有效解決模型的過擬合與變量共線性。

因此，本研究選擇PLS法旨在得到穩定性高、預測能力準確的丹參素鈉定量校正模型。

2.2.3 光譜預處理

圖2 大孔樹脂吸附分離階段的在線監測分析圖

本研究采用THUNIR V3.0（Demo）化學計量學分析系統，參考儀器自帶的優化功能，對光譜預處理方法進行優化，剔除干擾信號，提取關鍵信息，來選擇最佳光譜預處理方法提高模型的穩定性和預測的準確性。光譜預處理方法中，卷積平滑可以消除噪音對光譜的影響，多元散射校正和標準正態變量變換可以消除各批次間樣品產生的散射對其光譜的影響，一階卷積求導可以消除常數背景，二階卷積求導消除線性背景等等。不同的光譜預處理方法所建立的模型性能評價指標見表4。結果顯示丹參素鈉建模光譜最佳預處理方法為二階卷積求導。

2.2.4 建模波段的選擇

圖3 丹參素鈉定量校正模型預測趨勢圖

表4 丹參素鈉光譜預處理方法的選擇

表5 建模波段的比較結果表

偏最小二乘法雖可以處理全光譜信息，但因其中會含有大量無效的信息，故需要對最佳的波長范圍進行篩選，以消除干擾，提高模型的精度。本研究采用二階卷積求導的光譜預處理方法，通過比較全波長、相關系數法、迭代優化波長選擇方法，優選最佳建模波段為833～1 165 nm，1 498～1 890 nm，具體見表5。

2.2.5 模型的建立

運用化學計量學分析系統THUNIR V3.0（Demo）軟件，對上述光譜預處理方法和建模波段進行優選，依據標準方法的測定值，采用PLS法建模，得丹參素鈉定量校正模型的R2值為0.8473，SECV值為0.1776。

2.3 近紅外定量校正模型的外部驗證與在線驗證[16-19]

對劃分的外部驗證集和在線驗證集進行丹參素鈉的含量預測，并與HPLC法測定結果進行比較，外部驗證集的預測結果顯示，從純水洗脫開始，最初7個樣本和最終8個樣本的預測值和真實值的相對偏差大于10%，其余樣本的相對偏差都較??；在線驗證集的預測結果顯示，從純水洗脫開始，最初8個樣本和最終12個樣本的預測值和真實值的相對偏差大于10%，其余樣本的相對偏差都較小?？梢?，在大孔樹脂吸附分離過程中，水洗階段最初收集液部分和最終收集液部分中，所含丹參素鈉的含量太低，導致模型的預測不準確，只能準確預測出水洗液中丹參素鈉的含量趨勢和提示水洗的起點和終點，而中間部分由于洗脫液中丹參素鈉的含量高，所以可以準確預測，具體見圖3。

3 討論

本研究利用近紅外光譜法，在線對參芎葡萄糖注射液大孔樹脂吸附分離中試生產過程進行丹參素鈉的質量控制，通過二階卷積求導的光譜預處理方法和選擇最佳波段（833～1 165 nm，1 498～1 890 nm），結合PLS法建立定量校正模型，不僅可以準確預測大孔樹脂吸附分離過程中丹參素鈉的含量，同時可以準確判斷大孔樹脂吸附分離的起點和終點，在參芎葡萄糖注射液大生產中，可以實現丹參素鈉實時監控和在線分析，并且以其快速、環保的優勢為其產品的生產節約成本，提高效率，可以作為一種中藥制藥過程中質量控制的新方法在中藥制劑的復雜工藝中試行及推廣。

此外，大孔樹脂吸附分離過程不同于普通的提取過程，由于洗脫液中目標成分的含量是從無到有，再到無，結合近紅外光譜本身的缺點是不能檢測含量太低的物質，所以在采用近紅外檢測技術進行質量控制時，對洗脫的起點和終點，僅能做準確判斷，無法做到準確定量，目前應用暫僅對洗脫的中間部分進行準確定量。