近紅外無損檢測(cè)安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量＊

馬晉芳，王雪利，肖 雪，彭 銀，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；2.中山大學(xué)南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學(xué) 廣州510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006）

中藥市場(chǎng)中，當(dāng)進(jìn)行藥品抽樣檢驗(yàn)時(shí)，只是從大量樣品中隨機(jī)抽取少量樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并不能代表產(chǎn)品的整體質(zhì)量，且檢驗(yàn)方法復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，便利性較差。如安胎丸，是古代經(jīng)典方劑，由當(dāng)歸、制川芎、黃芩、炒白芍、白術(shù)打粉加工制成的中藥復(fù)方制劑，具有安胎功效，用于妊娠血虛、胎動(dòng)不安、面色淡黃、不思飲食、神疲乏力等病癥[1]。每盒裝為10丸，每丸6 g。當(dāng)前安胎丸的檢驗(yàn)，是依照《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑》進(jìn)行性狀、顯微鑒別、薄層鑒別以及丸劑的各項(xiàng)規(guī)定檢查[2]。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，僅通過指紋圖譜[1]及1-3個(gè)指標(biāo)性成分的定量[3-6]評(píng)價(jià)安胎丸的質(zhì)量。檢測(cè)指標(biāo)少，不能涵蓋組方藥材，且檢測(cè)手段需要進(jìn)行繁瑣的前處理，有必要開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、無損的檢測(cè)方法。

近紅外光譜法是一種利用化學(xué)物質(zhì)在近紅外譜區(qū)內(nèi)的光學(xué)特性快速測(cè)定物質(zhì)化學(xué)組分含量的光譜技術(shù)[7-8]。其特點(diǎn)是吸收系數(shù)較低、無損、快速、無污染，可以直接對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，不需要對(duì)樣品處理或僅需簡(jiǎn)單處理[9]。本研究中，采用近紅外漫反射光譜無損檢測(cè)的方法，即光投向安胎丸后，在丸劑內(nèi)部發(fā)生方向不定的反射[10]，直接對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。待近紅外漫反射光譜穿透至一定深度的蜜丸時(shí)，獲得更加完整的安胎丸整體信息，再結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)多批安胎丸中的每一丸進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的定量研究，建立一種抽樣檢驗(yàn)過程中更具有代表性的近紅外快速無損檢測(cè)安胎丸關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分含量的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；十萬分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；紫外分光光度計(jì)（UV-2600，島津（中國）有限公司）；近紅外光譜儀（SupNIR1500，聚光科技（杭州）有限公司）；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0，清華大學(xué)），在線監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)（THU NIR Online，清華大學(xué)）；阿魏酸（純度99.00%）、黃芩苷（純度93.50%）、漢黃芩苷（純度98.80%）、黃芩素（純度98.50%）、漢黃芩素（純度98.0%）和洋川芎內(nèi)酯A（純度98.0%），均購自于中國食品藥品研究院。乙腈（色譜級(jí)，購于德國默克公司），甲酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）、甲醇及其它試劑均為分析純。安胎丸（批號(hào)為：151101、151002、130701、151001、130602、130501、131101、131201、140401、140402、130601、140404，江西保利制藥有限公司）。

1.2 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分實(shí)際值的測(cè)定方法[11]

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加適量甲醇溶解配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，并稀釋至如下濃度：阿魏酸0.00306 mg?mL-1、黃芩苷0.10250 mg?mL-1、漢黃芩苷0.01840 mg ?mL-1、黃芩素 0.064 mg ?mL-1、漢黃芩素0.0378 mg?mL-1、洋川芎內(nèi)脂0.00715 mg?mL-1、白術(shù)內(nèi)酯0.042 mg?mL-1。

1.2.2 樣品溶液的制備

取1丸安胎丸，剪碎，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，即得供試品溶液（平行制備三份）。

1.2.3 色譜條件[11]及測(cè)定方法

色譜柱Diamonsil Plus C18-A(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）：乙腈（B），梯度洗脫（0-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-40%B；40-45 min，40%-70%B；45-55 min，70%-90%B；55-60 min，90%-95%B）；流速 0.8 mL·min-1；柱溫 35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；根據(jù)六種關(guān)鍵指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)公式(圖1)，達(dá)到了令人滿意的分離效果。樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液采用0.45 μm微孔膜過濾，分別取10 μL經(jīng)HPLC檢測(cè)。所測(cè)得的數(shù)值作為六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)性成分的含量真實(shí)值。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液均經(jīng)HPLC儀測(cè)定安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量。

1.3 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的近紅外測(cè)定方法

1.3.1 近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集

取12批（共108丸）的安胎丸樣品，采用近紅外光譜儀進(jìn)行近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集，按如下條件掃描：漫反射模式，分辨率2 nm，掃描次數(shù)32次，波長(zhǎng)掃描范圍1000-1800 nm。每丸重復(fù)掃描3次，得出平均的準(zhǔn)確的光譜數(shù)據(jù)保存為txt格式，并轉(zhuǎn)換為CVS格式。

1.3.2 光譜的預(yù)處理

光譜預(yù)處理對(duì)于獲得可靠、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的模型至關(guān)重要，因?yàn)榻t外的光譜的數(shù)據(jù)中可能包含噪聲、背景信息和其他干擾因素[12]。本研究中，分別近紅外采集的光譜進(jìn)行了預(yù)處理，比較了一階導(dǎo)數(shù)卷積（1stderivative，1DC）、二階導(dǎo)數(shù)卷積（2ndderivative，2DC）、多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正變變換（Standard Normal Variate，SNV）、Savitzky-Golay卷積平滑（S-G）和歸一化法（Normalization Method）等光譜預(yù)處理方法。

1.3.3 模型的建立及預(yù)測(cè)方法

采用THUNIR軟件[13-14]，根據(jù)HPLC測(cè)定的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的真實(shí)含量值，對(duì)采集到的光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理和波段選擇，選擇偏最小二乘法（partial least squares，PLS）[15]，建立六種成分的定量校準(zhǔn)模型。

模型的優(yōu)劣主要以交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）和相關(guān)系數(shù)（R2）進(jìn)行評(píng)估[12-13]。

采用建立的定量校正模型，對(duì)安胎丸中六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與HPLC測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的實(shí)際值測(cè)定

2.1.1 HPLC測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)考察

采用高效液相色譜法繪制了安胎丸六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線：阿魏酸：Y=56.5343 x+56.5343（0.0006-0.0245 μg）；黃芩苷：Y=43.9359 x+43.9359（0.0205-0.8200 μg）；漢 黃 芩苷 ：Y=57.4254 x+57.4254（0.0092-0.1840 μg）；黃芩素：Y=87.5326 x+87.5326（0.0128-0.5120 μg）；漢黃芩素：Y=90.0406 x+90.0406（0.0076-0.3780μg）；洋川芎內(nèi)酯 A：Y=14.5638 x+0.0075（0.0014-0.1072μg）。

方法學(xué)考察中，精密度試驗(yàn)的RSD值為0.53%-0.85%、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為2.28%-4.71%、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值為0.75%-4.00%，均低于5%。加樣回收率試驗(yàn)采用加入100%濃度的六份樣品進(jìn)行測(cè)定，回收率在98%-105%之間，RSD低于3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法學(xué)考察均符合要求，可見該HPLC測(cè)定方法的精度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高。

圖2 安胎丸的HPLC圖

表1 安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測(cè)定表（mg·pill-1）

續(xù)表1

表2 安胎丸關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測(cè)定表（mg·pill-1）

圖2是安胎丸樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC色譜圖，表明六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分不存在有峰干擾，且各成分歸屬于不同的色譜峰，可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量，定量結(jié)果見表1。

2.2 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的近紅外定量模型的建立

2.2.1 近紅外校正集樣本和驗(yàn)證集樣本的劃分

針對(duì)上述測(cè)定的每一批號(hào)中各丸所含質(zhì)控指標(biāo)成分的含量，將所有的樣本（108丸）分為校準(zhǔn)集和預(yù)測(cè)集。且分別由84個(gè)和24個(gè)樣本組成，如表2所示，并對(duì)校正集或驗(yàn)證集的六個(gè)質(zhì)控指標(biāo)成分含量進(jìn)行比較，校準(zhǔn)集的含量范圍更大，且含量數(shù)據(jù)分布均勻，符合建模條件。

2.2.2 近紅外光譜的特性分析

近紅外光譜分析常用的光譜區(qū)域是780-2500 nm，所測(cè)特征是分子振動(dòng)基頻，尤其是伸縮和彎曲振動(dòng)的倍頻和組合頻吸收帶[15]。圖3顯示了安胎丸的原始光譜圖和預(yù)處理光譜圖的光譜。在卷積平滑的光譜預(yù)處理中，1150-1210 nm、1300-1500 nm和1450-1600 nm均有較大響應(yīng)，這與-CH2、和-CH的二級(jí)倍頻、-OH的伸縮振動(dòng)有關(guān)[15]。

2.2.3 主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一種根據(jù)光譜分?jǐn)?shù)對(duì)不同樣本進(jìn)行分類的合適方法，可用于驗(yàn)證光譜的一致性[16]。圖4顯示了光譜的得分圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12批次安胎丸從其PCA得分圖看出，兩年內(nèi)生產(chǎn)的樣本不存在明顯的異常值。因此，108丸安胎丸具有光譜的一致性。

2.2.4 近紅外光譜的預(yù)處理和波段選擇

對(duì)近紅外光譜儀采集的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜預(yù)處理，可以消除偏移或基線的變化，從而保證光譜數(shù)據(jù)和成分之間很好的相關(guān)性[13]。在本研究中，選擇光譜掃描范圍為1000-1800 nm。考察幾種光譜預(yù)處理方法包括：S-G、1DC、2DC、MSC、SNV等不同預(yù)處理方法，最大程度地減少光譜中存在的干擾，并對(duì)上述光譜預(yù)處理方法進(jìn)行比較，分別選出最佳光譜預(yù)處理方法：六種質(zhì)控指標(biāo)成分的最佳光譜預(yù)處理方法均為卷積平滑（窗口數(shù)為11，擬合次數(shù)為3）[17]。

校正模型建立時(shí)，有時(shí)并不需要所有的光譜數(shù)據(jù)都參與校正，而只用某些光譜區(qū)間就可以得到很好的校正效果，這樣可以減少參與建模的數(shù)據(jù)量，降低不相關(guān)區(qū)間的噪音干擾。因此，本研究中，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件提供的光譜區(qū)間選擇功能，進(jìn)行不同的波長(zhǎng)選擇方法的比較，優(yōu)選出最佳波段進(jìn)行模型的建立，最佳波段的優(yōu)選結(jié)果見表3。

圖4 安胎丸全部樣本的近紅外光譜PCA得分圖

2.2.5 模型主因子數(shù)的確定

采用PLS方法建立定量分析模型時(shí)，主因子數(shù)的選擇直接影響到模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力，如果選擇的主因子太少，將會(huì)丟失原始光譜較多的有用信息，導(dǎo)致擬合不充分；如果選擇主因子太多，會(huì)將測(cè)量噪音過多的包括進(jìn)來，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，所建模型的預(yù)測(cè)誤差會(huì)顯著增大[18]。本研究以黃芩苷為例，隨著主因子數(shù)增加，SECV陡然下降，防止存在過擬合現(xiàn)象，因此，選擇主因子數(shù)為7。

2.2.6 建立最佳定量校準(zhǔn)模型

定量校正也稱多元校正[19]，是指在物質(zhì)含量與分析儀器響應(yīng)值之間建立定量關(guān)聯(lián)關(guān)系。PLS屬于線性方法，是基于有偏估計(jì)的方法，能同時(shí)對(duì)回歸問題進(jìn)行降維處理[19]。

本研究中根據(jù)表1中六種質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果，采用THUNIR軟件，應(yīng)用卷積平滑的光譜預(yù)處理方法，選擇優(yōu)化后的最佳波長(zhǎng)，結(jié)合偏最小二乘法分別建立近紅外光譜測(cè)定安胎丸六種成分的定量校正模型。六種成分的定量分析模型參數(shù)見表3。

圖5 黃芩苷定量分析校正模型最佳主因子數(shù)的選擇

2.3 定量校準(zhǔn)模型的驗(yàn)證

采用建立的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的定量校準(zhǔn)模型，分別對(duì)剩余的24個(gè)驗(yàn)證集樣本進(jìn)行含量預(yù)測(cè)，如圖6，結(jié)果顯示安胎丸中的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)性成分的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值高度匹配，其預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.90，表明六個(gè)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

表3 安胎丸質(zhì)控指標(biāo)成分最佳模型校正參數(shù)

圖6 安胎丸六種質(zhì)控指標(biāo)性成分的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值擬合圖

3 討論

本研究采用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)，成功地對(duì)安胎丸進(jìn)行了六種質(zhì)控指標(biāo)成分的定量分析，該方法可以無損、快速、準(zhǔn)確地對(duì)該中成藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。與市場(chǎng)抽樣檢驗(yàn)方法比較，可以節(jié)省大量分析時(shí)間及費(fèi)用，有著良好的市場(chǎng)實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景，為中成藥市場(chǎng)的抽樣檢驗(yàn)提供新思路和新方法。