滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛大鼠空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5表達(dá)的影響＊

孫曉霞，戰(zhàn)麗彬＊＊，侯圣林，江玉翠，楊關(guān)林

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中醫(yī)脾藏象現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)室 南京 210023；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 沈陽(yáng) 110032）

“脾主運(yùn)化”為“后天之本”的物質(zhì)基礎(chǔ)，是指將飲食水谷消化、吸收并將其中之精微轉(zhuǎn)輸至周身的過程。這一過程伴隨著能量不斷的生成與消耗，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)與能量代謝的調(diào)控[1]。糖類作為一種精微物質(zhì)，能夠?yàn)闄C(jī)體提供所需能量，保障生命活動(dòng)的順利進(jìn)行[2]。糖類在小腸的吸收是運(yùn)化精微的重要表現(xiàn)形式之一[3]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporters，GLUTs）作為一種跨膜運(yùn)載體，是以易化擴(kuò)散方式介導(dǎo)糖代謝的關(guān)鍵性物質(zhì)[4]。臨床上脾虛證患者出現(xiàn)脾失健運(yùn)的表現(xiàn)與消化系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)吸收功能障礙有關(guān)，同時(shí)存在腸道黏膜上GLUTs的異常，提示機(jī)體對(duì)精微物質(zhì)的吸收功能依賴于GLUTs[5]。本研究以脾陰虛大鼠模型為研究對(duì)象，基于“脾主運(yùn)化”理論，探討脾陰虛大鼠空腸GLUT1和GLUT5表達(dá)的變化及滋補(bǔ)脾陰方藥（ZBPYR）的干預(yù)作用，為進(jìn)一步豐富“脾主運(yùn)化”的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量200±20 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011]。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，溫度22±3℃。

1.2 主要試劑與藥物

RIPA裂解液（碧云天，P0013B）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×（碧云天，P00015L）；蛋白Marker（Thermo，26617）；Anti-Glucose Transporter GLUT1 抗體（Abcam，ab652）；Anti-Glucose Transporter 5 GLUT5抗體（Abcam，ab41533）；β-actin Mouse mAb（CST）；羊抗小鼠IG-HRP（博士德）；羊抗兔IG-HRP（博士德）；ECL發(fā)光液（天能，180-5001）；康為世紀(jì)RNA pure Tissue&Cell Kit試劑盒（CWO584S）；諾維贊vazyme AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix（High Rox Premixed）試劑盒。

傷陰藥（吳茱萸、制附子、肉桂，混合比例為1∶1∶1），購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門診部。滋補(bǔ)脾陰方藥（紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g等），購(gòu)于大連醫(yī)藥集團(tuán)藥材公司。常規(guī)水煎，傷陰藥生藥濃度1 g/mL，滋補(bǔ)脾陰方藥生藥濃度3.29 g/mL，過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

精密天平（奧豪斯，美國(guó)）；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琪，瑞士）；小型垂直電泳槽（Bio-Rad，美國(guó)）；NanoDrop One超微量分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）；高速分散均質(zhì)機(jī)（KAT10 basic，德國(guó)）；Real-time PCR儀（ABI 7500，美國(guó)）；小型冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Thermo Micro CL 17R，美國(guó)）。

1.4 分組、模型建立及給藥方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，雙盲隨機(jī)分為正常組6只，脾陰虛模型組14只。采用經(jīng)典復(fù)合因素方法，以饑飽失常與過勞結(jié)合燥熱耗傷陰液法建立脾陰虛動(dòng)物模型，分為脾氣虛和脾陰虛兩個(gè)階段[6-7]。第1-14天為脾氣虛造模階段：飽食1日+禁食2日，3日為1個(gè)循環(huán)。期間自由飲水。每日游泳至力竭，游泳桶內(nèi)徑25 cm，水深35 cm，水溫22℃。第15-24天為脾陰虛造模階段：第15天，將符合脾氣虛標(biāo)準(zhǔn)的模型納入脾陰虛造模階段。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡1只，排除不符合脾氣虛標(biāo)準(zhǔn)大鼠1只。將剩余12只大鼠納入脾陰虛造模階段。模型組在脾氣虛證基礎(chǔ)上，每日增加傷陰藥灌胃（1 ml/100 g/只）。其余予以等體積的生理鹽水灌胃。第25-38天為滋補(bǔ)脾陰方藥給藥階段：將脾陰虛模型組分為脾陰虛組（6只）和滋補(bǔ)脾陰方藥組（6只），滋補(bǔ)脾陰方藥組按照1 ml/100 g/只/天胃飼ZBPYR，余組予以等體積生理鹽水胃飼。

1.5 模型評(píng)價(jià)

參考《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》及《中醫(yī)新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8-9]，綜合擬定脾氣虛證評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：①食少；②神疲乏力；③消瘦；④毛色枯槁無光澤，便軟或溏。脾陰虛證評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：①體質(zhì)量下降，消瘦；②易激惹，咬斗；③肛溫升高；糞便干燥；④背毛枯稿無光澤；⑤飲食量時(shí)增時(shí)減；⑥飲水量增多；⑦游泳耐力下降。

表1 qPCR法檢測(cè)空腸GLUT1和GLUT5 mRNA表達(dá)

表2 脾氣虛造模階段各組大鼠體質(zhì)量、肛溫情況（xˉ±s）

1.6 qPCR法檢測(cè)空腸GLUT1和GLUT5 mRNA表達(dá)

提取各組大鼠近端空腸組織總的RNA，按照康為世紀(jì)RNA pure Tissue&Cell Kit試劑盒說明書提示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作并檢測(cè)RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85°C 5 s，4℃保存。合成cDNA模板后采用SYBR Green I相對(duì)定量分析。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，具體引物序列詳見表1。qPCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s 40 個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s終止反應(yīng)。

1.7 Western Blot法檢測(cè)空腸GLUT1與GLUT5蛋白表達(dá)

取大鼠近端空腸組織提取總蛋白，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算蛋白上樣量。將蛋白樣品分別加入10%和5%的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶于室溫條件下?lián)u床封閉2 h，按照1∶1 000加入一抗，4℃孵育過夜。第2日1×TBST充分洗膜（5 min×3），加入二抗（1∶2 000），1×TBST充分洗膜（5 min×3），ECL發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。兩組間比較行T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，多組間比較行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各階段大鼠體質(zhì)量和肛溫變化比較

脾氣虛造模階段（表2）：與正常組比較，脾氣虛組大鼠體質(zhì)量和肛溫明顯降低（P＜0.001）。脾陰虛造模階段（見表3）：與正常組比較，脾陰虛組大鼠體質(zhì) 量顯著降低（P＜0.001）；肛溫較正常組顯著降低（P＜0.001），但較脾氣虛造模階段肛溫呈上升趨勢(shì)。滋補(bǔ)脾陰給藥階段（見表4）：與正常組比較，脾陰虛組和滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.001）；相比于脾陰虛組，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肛溫?zé)o顯著性差異。

表3 脾陰虛造模階段各組大鼠體質(zhì)量、肛溫情況

表3 脾陰虛造模階段各組大鼠體質(zhì)量、肛溫情況

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別正常組脾陰虛組n 6 1 2體質(zhì)量/g 334.73±11.11 252.44±29.03***肛溫/℃34.73±0.20 34.09±0.32***

表4 滋補(bǔ)脾陰給藥階段各組大鼠體質(zhì)量、肛溫情況

表4 滋補(bǔ)脾陰給藥階段各組大鼠體質(zhì)量、肛溫情況

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別正常組脾陰虛組滋補(bǔ)脾陰方藥組n 6 6 6體質(zhì)量/g 372.17±12.76 326.362±22.38***339.01±28.83***肛溫/℃35.07±0.12 35.03±0.20 35.01±0.21

表5 各組大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5 mRNA表達(dá)比較

組別正常組脾陰虛組滋補(bǔ)脾陰方藥組GLUT1 mRNA 1.00±0.00 0.71±0.12*1.54±0.22*##GLUT5 mRNA 1.00±0.00 0.33±0.33*1.03±0.47##

2.2 模型評(píng)價(jià)

大鼠生物學(xué)特征評(píng)估：正常組大鼠反應(yīng)敏捷，活動(dòng)迅速，毛發(fā)光澤，眼神靈活，大便正常；脾陰虛組大鼠體重下降，易激惹、咬斗，背毛枯槁無光澤，肛溫呈升高趨勢(shì)，糞便干燥，進(jìn)食量時(shí)增時(shí)減，飲水量增多。綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本符合脾陰虛動(dòng)物模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5 mRNA含量的表達(dá)

結(jié)果表明（表5、圖1），與正常組相比，脾陰虛組GLUT1、GLUT5 mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05），滋補(bǔ)脾陰方藥組GLUT1 mRNA的表達(dá)含量增加（P＜0.05）；與脾陰虛組相比，滋補(bǔ)脾陰方藥組GLUT1 mRNA和GLUT5 mRNA的表達(dá)含量均明顯增加（P＜0.01）。

2.4 大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5蛋白含量的表達(dá)

圖1 大鼠空腸組織GLUT1和GLUT5mRNA表達(dá)比較

圖2 大鼠空腸組織GLUT1和GLUT5蛋白表達(dá)比較

結(jié)果表明（圖2），與正常組相比，脾陰虛組GLUT1、GLUT5蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；與脾陰虛組相比，滋補(bǔ)脾陰方藥組GLUT1、GLUT5蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

3 討論

精微物質(zhì)在“脾主運(yùn)化”作用下得以轉(zhuǎn)輸至全身，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來源以及維持正常生命活動(dòng)的重要保證[10-11]。脾陰是具有滋潤(rùn)五臟六腑、濡養(yǎng)全身及補(bǔ)益腦髓等功能的精微物質(zhì)，由水谷精微所化，泛指營(yíng)血、津液、脂膏等一切陰液?！捌⒅鬟\(yùn)化”不僅依賴于脾氣、脾陽(yáng)，同時(shí)也依賴于脾陰所發(fā)揮的生理作用。脾臟病變多以虛證為主，脾陰虛是脾虛證之一?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄·例言》曰：“脾為太陰，乃三陰之長(zhǎng)”，故傷陰者，脾陰首當(dāng)其沖。脾陰虛證的病因病機(jī)與臟腑陰陽(yáng)的偏盛偏衰及氣血津液的相互轉(zhuǎn)化相關(guān)，凡飲食失調(diào)、憂思勞倦、五臟虛損以及妄投醫(yī)藥等原因引起的陰陽(yáng)氣血虧虛,皆可導(dǎo)致脾陰的功能障礙[12]。其中，妄用大辛大熱之劑可致脾陰受劫，是導(dǎo)致脾陰虛證的重要因素之一。正如《明醫(yī)雜著》言：“所用之藥，又有辛溫燥熱助火消陰之劑，遂致胃火益旺，脾陰愈傷”。脾陰虛證的病機(jī)實(shí)質(zhì)為脾的“氣陰兩虛”[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)基于“飲食失節(jié)，脾胃乃傷”、“勞倦傷脾”以及“勞則氣耗”等中醫(yī)基礎(chǔ)理論，采用經(jīng)典復(fù)合因素造模方法，在建立脾氣虛動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，予以辛溫燥熱耗傷陰液之劑，成功復(fù)制了脾陰虛大鼠模型。

脾陰不足則影響機(jī)體納運(yùn)水谷以及化生精微的過程，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙、物質(zhì)轉(zhuǎn)換與能量代謝的異常[14]。糖類是為生命體提供能量的主要物質(zhì)來源[15]。在GLUTs的協(xié)助下，葡萄糖以易化擴(kuò)散的方式進(jìn)出細(xì)胞膜，是糖代謝順利進(jìn)行并保障能量供應(yīng)的重要前提[16]。GLUT1是目前研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)分布最為廣泛的基礎(chǔ)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，不具有組織特異性。有研究表明，脾虛大鼠空腸上皮細(xì)胞GLUT1表達(dá)顯著降低，艾灸通過上調(diào)GLUT1表達(dá)促進(jìn)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。呂林等[18]通過研究脾虛型功能性消化不良大鼠發(fā)現(xiàn)其小腸GLUT1表達(dá)減少，這一結(jié)果提示我們可以從一個(gè)新的角度探索脾虛證的本質(zhì)。此外，GLUT5也能夠明顯影響小腸對(duì)單糖的吸收[19]。GLUT5是果糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，主要表達(dá)位點(diǎn)是小腸上皮細(xì)胞膜頂端，利用底物順濃度差轉(zhuǎn)運(yùn)入小腸上皮細(xì)胞[20]。正常飲食攝入的果糖主要在小腸中被處理掉[21]。攝入果糖過量會(huì)影響人體的健康狀況，導(dǎo)致如肥胖、胰島素抵抗及高血壓等疾病的發(fā)生[22]。研究顯示大鼠在饑餓條件下空腸GLUT5表達(dá)含量減少，而經(jīng)高糖喂食后表達(dá)明顯增加，這一研究結(jié)果說明了GLUT5對(duì)空腸的單糖吸收具有重要意義[23]。

通過觀察脾陰虛大鼠模型發(fā)現(xiàn)：空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，這與在脾氣虛和脾陽(yáng)虛大鼠模型中表達(dá)水平降低的結(jié)果相一致[24-25]。本研究立足于脾陰虛證，在脾氣虛證、脾陽(yáng)虛證的基礎(chǔ)上完善了對(duì)脾虛證的研究，說明在脾虛狀態(tài)下，空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達(dá)含量均有不同程度下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GLUT1、GLUT5可能參與脾陰虛狀態(tài)下糖代謝紊亂的病理過程。脾陰虛狀態(tài)下空腸GLUT1、GLUT5基因與蛋白表達(dá)的降低，可能是小腸對(duì)單糖吸收減少，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體能量代謝發(fā)生障礙的重要機(jī)制之一，進(jìn)一步豐富了脾虛證科學(xué)內(nèi)涵。

中醫(yī)論治脾陰虛證一直以滋養(yǎng)脾陰為根本大法[26]。正如張錫純所言：“脾陰虛者，當(dāng)以滋脾陰為主，脾陰足自能灌溉諸臟腑”[27]。ZBPYR是戰(zhàn)麗彬教授結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)清代吳澄《不居集》中資成湯化裁而成。在本研究中，ZBPYR給藥后GLUT1、GLUT 5的mRNA和蛋白表達(dá)含量較脾陰虛組均顯著提高，提示ZBPYR在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平增加了GLUT1、GLUT5合成，通過上調(diào)其表達(dá)水平，改善脾陰虛大鼠糖代謝紊亂的異常狀態(tài)。

綜上，ZBPYR通過上調(diào)脾陰虛大鼠空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達(dá)，可能是其發(fā)揮對(duì)脾陰虛證干預(yù)作用的機(jī)制之一。ZBPYR具有滋補(bǔ)脾陰，健脾益氣之效，對(duì)改善葡萄糖代謝紊亂具有重要意義，為臨床治療脾陰虛證及理論研究提供了新思路。但能量代謝過程復(fù)雜，涉及多靶點(diǎn)多途徑調(diào)控，本次研究?jī)H從葡萄糖在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體入手，故對(duì)脾陰虛與能量代謝的關(guān)聯(lián)途徑與作用機(jī)制等仍需深入探索。此外，ZBPYR對(duì)脾陰虛證干預(yù)后，是否能夠調(diào)節(jié)除糖代謝之外的影響機(jī)體能量代謝的異常變化，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。