KGF-2對COPD小鼠保護性作用的免疫學研究

張 鴿 常美佳 黃嘉楠 周 建 宋元林 白春學 洪群英

(復旦大學附屬中山醫院呼吸科 上海 200032)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統的常見疾病,嚴重危害人類健康,以氣道不完全可逆性氣流受限為特征。COPD主要累及肺,也可以引起全身炎癥及免疫環境的紊亂,具體機制尚未闡明。COPD可能是一種由煙草煙霧誘發、T細胞參與的炎癥反應及自身免疫疾病[1-2]。角質細胞生長因子2 (keratinocyte growth factor-2,KGF-2)也被稱為FGF10,是含有208個氨基酸殘基的多肽,隸屬于FGF家族,結構與KGF相似,能夠高親和力結合FGF-2受體。FGF-2受體廣泛分布于各種上皮細胞[4]。KGF-2可由間質細胞分泌,能有效促進各種上皮細胞的增殖、遷移和分化,并直接作用于上皮細胞,促進傷口邊緣細胞再生和修復,或間接刺激其他細胞因子的分泌,促進肉芽組織形成并減少瘢痕的產生,對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的急性肺損傷有較強的保護性作用[5]。本文擬通過建立COPD小鼠模型,觀察KGF-2對COPD小鼠肺部及全身炎癥和免疫環境的影響,以探討KGF-2對于COPD保護性作用的機制。

材 料 和 方 法

實驗動物及分組15只雄性SPF級健康BALB/C小鼠,6～8周齡,體重20～25 g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。復旦大學附屬中山醫院中心實驗室按標準顆粒飼料喂養,自動取食飲水。將15只小鼠隨機分為3組:正常對照組(對照組)、COPD模型組(COPD組)及KGF-2治療組(KGF-2 組),每組5只。

主要藥物和試劑KGF-2(上海新生源公司);市售大前門牌香煙:焦油量15 mg,氣煙堿量1.1 mg;BCA試劑盒(碧云天公司);小鼠IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α) ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);戊巴比妥鈉(德國默克公司);CD3+、CD4+、CD8+、PD-1流式熒光抗體(美國BD公司)。

主要儀器煙霧發生器(美國Data Sciences International公司),低溫高速離心機(型號:5804R,德國Eppendorf公司),流式細胞檢測儀(美國BD公司),有機玻璃毒染箱(120 cm×80 cm×80 cm)由復旦大學附屬中山醫院呼吸科自制。

動物模型復制利用煙熏加LPS氣道內滴注的方法建立小鼠COPD模型。正常對照組自由飲水和攝食,不做任何處理;COPD組小鼠置于有機玻璃毒染箱(120 cm×80 cm×80 cm)內進行被動吸煙,每天2次,每次10支,每次持續30 min,2次間隔至少4 h,連續30天,并在第1天和第14天氣管內滴入50μL LPS (1 mL/kg),滴注LPS當天暫停吸煙2次。

給藥方法在煙熏第1天及第14天,對照組氣管內滴注生理鹽水50μL各1次。COPD組在煙熏第1天及第14天,氣管內滴注LPS 25μg(50μL)/次。KGF-2組在煙熏第1天及第14天,氣管內滴注LPS(1 mg/kg)及KGF-2 (5 mg/kg),共2次,50μL/次。

取材腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進行麻醉,眼球取血,于4 ℃下900×g離心5 min,分離血清于-80 ℃保存。取血后開胸,氣管插管并固定,使用1 mL注射器以無菌PBS行右肺肺泡灌洗,回收率>80%,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于4 ℃下900×g離心10 min,取上清于-80 ℃保存。留取左肺(未灌洗過的肺組織)放入中性4%甲醛溶液,固定48 h后常規石蠟包埋、切片,肺組織HE染色,用于顯微鏡下觀察肺內支氣管損傷以及支氣管、肺組織炎癥細胞浸潤情況,其余肺組織于-80 ℃保存。留取脾臟,研磨過濾后得到單細胞懸液,于-80 ℃保存。

指標檢測運用BCA法測定BALF中蛋白質濃度,全自動酶標儀在562 nm處檢測各孔的吸光度值(D)。運用ELISA方法測定血清和BALF中IL-6和TNF-α的水平,嚴格按照試劑盒說明書操作,全自動酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度(D)值。運用流式細胞術測定脾臟中CD4+T細胞、CD8+T細胞及PD+T細胞的比例,運用Flowjo V9軟件進行分析。

結 果

小鼠肺組織HE染色對照組可見支氣管和肺泡結構清晰,黏膜無明顯破壞及炎癥細胞浸潤的表現;COPD組小鼠肺結構雜亂,破壞較明顯,肺泡壁斷裂,支氣管黏膜上皮細胞變形、壞死,纖毛不齊、變短、倒伏甚至脫落,管壁增厚,周圍有大量炎癥細胞浸潤,管腔狹窄或扭曲擴張;與COPD組比較,KGF-2治療組肺泡結構破壞減輕,炎癥細胞浸潤減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色Fig 1 HE staining in lung tissues of different mice groups

小鼠BALF中蛋白質濃度與對照組比較,COPD組和KGF-2組BALF中蛋白質濃度明顯升高(P<0.05),但是KGF-2組與COPD組差異無統計學意義(圖2,表1)。

圖2 各組小鼠BALF中蛋白濃度的比較Fig 2 Protein concentration in BALF of different mice groups

小鼠BALF及血漿中IL-6和TNF-α水平與對照組比較,COPD組BALF和血漿中IL-6和TNF-α顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組BALF和血漿中IL-6和TNF-α稍有下降,差異無統計學意義(圖3,表1)。

小鼠脾臟CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+細胞比例明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD4+T細胞比例明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD8+T細胞比例明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD8+T細胞比例稍有上升,差異無統計學意義。與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+T/CD8+T明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組CD4+T/CD8+T未見明顯改變(圖4)。

圖3 各組小鼠BALF和血漿中IL-6和TNF-α水平Fig 3 IL-6 and TNF-α levels in BALF and plasma of different mice groups

圖4 各組小鼠脾臟中T細胞的分布情況Fig 4 Distribution of T cells in spleen of different mice groups

小鼠脾臟細胞PD-1的表達與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+T細胞中PD-1的表達比例明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD4+T細胞中PD-1的表達比例明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05)。與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD8+T細胞中PD-1的表達比例明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05,圖4)。

討 論

KGF-2對LPS引起的急性肺損傷有較強的保護性作用。在急性肺損傷模型中,我們分別驗證了KGF-2在1、2、5及10 mg/kg時的保護性作用,結果顯示在5 mg/kg時保護性作用最強。基于之前的結果[4],本次實驗采用5 mg/kg、氣管插管、共給藥2次(分別在第14天和第30天)的實驗方法。

KGF-2可有效促進各種上皮細胞的增殖、遷移和分化,并直接作用于上皮細胞,促進傷口邊緣細胞再生和修復,或間接刺激其他細胞因子的分泌,促進肉芽組織形成并減少瘢痕的產生[5]。此外,KGF-2可以通過減少炎癥因子的釋放,從而減少T細胞的過度增殖[6-7]。經KGF-2治療的小鼠CD4+T細胞及CD8+T細胞的比例明顯高于COPD組小鼠,PD-1表達陽性的T細胞比例降低。此結果說明KGF-2可以減輕T細胞介導的炎癥反應,提高免疫功能。

COPD的主要特征是肺部及全身的慢性炎癥及免疫失調,巨噬細胞、T淋巴細胞和嗜中性粒細胞在肺部浸潤增加[8-11]。活化的炎癥細胞釋放各種炎癥介質,包括IL-6和TNF-α等[12]。IL-6作為一種多效應的細胞因子可由多種細胞產生,它能抑制巨噬細胞釋放TNF-α,減輕炎癥反應[13-14]。TNF-α是導致COPD慢性炎癥損傷和肺實質毀損的重要細胞因子。吸煙可導致支氣管上皮細胞受損,組織或肺泡巨噬細胞和上皮細胞分泌TNF-α,促進炎癥因子的趨化和活化,導致氣道結構破壞[15]。TNF-α還能誘導支氣管上皮細胞INF-γ受體表達,后者能夠上調細胞PD-L1的表達[16]。TNF-α可誘導氣道黏液細胞化生和分泌增多,導致小鼠肺氣腫性損害和肺泡壁膠原沉積[17]。本研究發現在COPD模型小鼠的BALF和血漿中IL-6和TNF-α的含量明顯升高,經KGF-2治療后的COPD小鼠IL-6和TNF-α水平較COPD組小鼠有所下降,由此說明KGF-2對COPD小鼠的肺部及全身炎癥有一定的改善作用。

近年來研究發現,香煙等有害氣體刺激機體啟動固有免疫,固有免疫破壞肺組織,裂解出來的彈力蛋白片段成為抗原,又啟動了T細胞介導的獲得性免疫[18-19]。PD-1是表達在效應T細胞表面的一個負向調控共刺激分子,在持續的炎癥性免疫應答中表達會上調,通過與配體PD-L1和PD-L2相互作用,抑制外周組織中持續免疫反應,并阻止自身組織受到免疫損傷[20]。吸煙的COPD患者肺內存在寡克隆CD4+T細胞聚集,COPD可能是一種由煙草煙霧誘發、T細胞參與的炎癥反應及自身免疫疾病。COPD患者常常存在氣道及全身炎癥及免疫失調,導致容易發生感染及急性加重。T淋巴細胞亞群各細胞成分間比例的維系是正常免疫反應的細胞學基礎,T淋巴細胞在抗原的刺激下呈現亞群比例紊亂,導致免疫反應不恰當增強或減弱,造成組織損傷或炎癥的持久存在,這可能是COPD病情進展的機制之一[20]。已有研究證實,在COPD緩解期,外周血CD4+T細胞數目及CD4+/CD8+T細胞相對于對照組有所降低[16]。在我們的研究中,COPD小鼠CD4+T細胞和CD8+T細胞比例明顯低于對照組,PD-1表達陽性的T細胞比例升高,提示COPD小鼠免疫反應減弱。經KGF-2治療的小鼠CD4+T細胞及CD8+T細胞的比例明顯高于COPD組小鼠,PD-1表達陽性的T細胞比例降低,提示KGF-2可以提高小鼠脾臟中CD4+T細胞及CD8+T細胞數量,并部分恢復CD4+T細胞的免疫活性。

本研究結果說明KGF-2對于炎癥損傷的保護性作用有限,但是對于增強免疫功能有一定的作用,提高了CD4+T細胞的比例和活性及CD8+T細胞的數量。CD4+T細胞的分類及機制有待進一步探討。

綜上所述,KGF-2通過降低肺部及全身IL-6和TNF-α水平及提高CD4+T細胞和CD8+T細胞比例,降低T細胞PD-1的表達來改善COPD,提示KGF-2在一定程度上能改善COPD慢性炎癥反應及增強免疫力。