GGNBP2與GGN在小鼠睪丸生精細胞定位及作用

郭凱敏 梁作文 田潤輝 劉凌云*

1. 吉林大學第一醫院男科（長春 130021）; 2. 吉林大學第一醫院心理衛生科

不孕不育是一種威脅人類生殖健康的疾病，也是困擾世界醫學界的難題。據報道，全世界約10%～15%的夫妻患有不孕不育，其中男性因素約占30%～55%。近幾年，環境問題尤其是環境對男性精子的影響越來越受到關注。配子生成素結合蛋白2（gametogenetin binding protein 2 ，GGNBP2），又稱鋅指蛋白403，于2001年由Ohbayashi首次報道[1]。 已有大量研究表明該蛋白表達與卵巢癌[2,3]、喉癌[4]、乳腺癌[5]、腦膠質瘤[6]密切相關。該基因在睪丸組織中高表達，在精子發生中發揮重要作用。Chen報道GGNBP2缺失影響睪丸形態以及SOX-9支持細胞的功能[7]。我們前期研究也報道GGNBP2敲除引起雄性小鼠無精子癥，生精過程阻滯于精子細胞，生精上皮管腔完整性破壞，精子頂體畸形[8]。本實驗通過免疫熒光、免疫沉淀技術，探討GGNBP2與配子生成素（GGN）關系，以及Ggnbp2基因敲除對GGN mRNA和蛋白水平的影響及定位改變，從而初步揭示Ggnbp2基因缺失引起睪丸生精障礙的機制。

材料和方法

一、實驗動物和主要試劑

Ggnbp2基因敲除小鼠先由C57BL/6雌性小鼠與野生型129/Sv雄性小鼠交配獲得雜合型，然后雜合型Ggnbp2小鼠交配最終獲得純合型敲除小鼠。動物合格號：SCXK（京）2014-0013。配子生成素結合蛋白2抗體（GGNBP2）（美國Pacific Immuno.Corp）、配子生成素（GGN）抗體（美國Aviva System Biology）、β-Actin（美國Santa Cruz Biotech.公司）、二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔或山羊抗鼠IgG（美國Santa Cruz Biotech.公司）。SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），二氧化碳培養箱（德國Binder公司）。敲除小鼠基因型鑒定PCR正向引物: 5’ AGTGCCATTTACCCACCAAG 3’ 反向:5’ GAAAGGAGGAGGGAAAGGAA 3’。CKX41-A32PH倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。低速離心機（美國Sigma公司）

二、免疫共沉淀檢測蛋白相互作用

睪丸組織蛋白濃度測定后，分裝3管，200μg蛋白量用于免疫沉淀，50μg蛋白加入1/3體積3×loading buffer 煮沸10min，用于Input。PBS清洗agarose A/G 珠子兩次，加入用于免疫沉淀的蛋白裂解液，加RIPA（含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑）至200μL，再加入等體 2×沉淀緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1%TritonX-100，pH 8.0），4℃沉淀1h。3 000×g離心，將上清液移至新管，1管加入1μg相應抗體，另一管作為IgG對照，每管中分別加入20μL蛋白A/G 珠子，4℃旋轉過夜。次日用洗脫液A（50mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA，0.5%TritonX-100, pH 8.0）洗滌珠子3次， 洗脫液B（10mmol/L Tris-HCl，0.1%TritonX-100 pH7.5）洗滌1次，低速離心，棄上清，加入40μL RIPA與1/3體積3×loading buffer混合，100℃煮沸10min，離心后，加入20μL上樣到SDS-PAGE膠，進行電泳，剩余-20℃保存。

三、睪丸生精細胞的分離

取睪丸組織，置于室溫1×KREBS 液，剔除附睪、輸精管、睪丸白膜后，置于50mL 管中，加入濃度為1mg/mL膠原酶5mL和2mg/mL胰蛋白酶，置于33℃溫水浴孵育，靜置5min，棄上清，加入3μL DNAse，100μm過濾網過濾，取細胞懸液顯微鏡下觀察細胞形態，可見分散的睪丸各級生精細胞。PBS洗滌兩次，用于后續檢測。

四、RT-PCR 檢測基因表達

應用T R I z o l試劑盒（按說明書操作）提取睪丸組織分離的生精細胞R N A，進行R T-P C R檢測。設計G G N 正向引物：5’GGCTGAGATAATATTGGAGGACAG 3’ ，反向引物：5’ GAAGAGCCCGTGGGTTT 3’ 。引物由上海生工技術服務公司合成。PCR反應條件：95℃、3min，94℃、40s；57℃、50s，72℃、1min，30個循環；72℃、7min。PCR產物相對表達水平=靶基因相對灰度值/ β-Actin，蛋白相對表達水平=靶蛋白相對灰度值/ β-Actin。

五、免疫印跡檢測蛋白水平的表達

取新鮮睪丸組織，去白膜后，加入適量RIPA細胞裂解液Brandford，組織勻漿器冰上操作20s，超聲波粉碎儀裂解處理10s后，4℃高速12 000×g離心15min；Brandford蛋白定量后SDS-PAGE電泳，電壓120v，PVDF濕轉（電壓150v，120min），5%脫脂牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過夜，次日TBS-T洗膜3次，每次5min，相應二抗室溫孵育1h。X片暗室曝光，計算機掃描條帶，并與β-Actin條帶進行對比分析獲得各自相對表達水平。

六、精母細胞染色體分散實驗和免疫熒光、免疫組化檢測

實驗方法依照Kobayashi報道[9]。 取30d小鼠睪丸組織，剔除白膜后，低滲緩沖液（30mmol/L Tris-Base，50mmol/L蔗糖 ，17mmol/L 二水枸櫞酸三鈉，5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，0.5mmol/L PMSF ，pH8.2），室溫作用30～60min。滴100mmol/L蔗糖溶液于載玻片，取少許睪丸組織置于其上，組織剪剪碎至小塊，用蓋玻片左右推片3～4次，將1%PFA溶液滴于覆蓋的玻片上，濕盒固定1h，使用前PBS洗1～2次。10%donkey 血清室溫封閉1h，用待檢測抗體4℃孵育過夜。次日分別加入含有熒光的二抗，避光孵育1h，DAPI復染，熒光顯微鏡觀察。肉眼計數免疫染色Foci改變。

成年雄性小鼠睪丸經脫水、固定、石蠟包埋后切片，經脫蠟、過氧化氫滅活、高溫抗原修復處理、4%羊血清封閉后，加入一抗4℃過夜。次日加入相應二抗孵育，DAB 顯色和復染，在蘇木素染色液中復染 30～60 s，經梯度酒精脫水、透明，封片保存。

七、統計學分析

采用SPSS17.0 統計學分析軟件進行分析。所有計量資料均符合正態分布。組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為有統計學差異。

結 果

一、GGNBP2與GGN相互作用

采用野生型成年小鼠睪丸組織蛋白200μg，行免疫沉淀，結果提示GGN能夠沉淀GGNBP2，同時GGNBP2也能夠沉淀GGN，提示GGNBP2與GGN相互作用，見圖1。

二、GGNBP2與GGN在精母細胞和精子細胞的定位。

分離60d野生型小鼠睪丸生精細胞，應用免疫熒光觀察精母細胞和精子細胞4個期間（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2與GGN的表達定位，DAPI標記細胞核，結果顯示GGNBP2與GGN均定位于精母細胞的細胞核和細胞漿，且在精子細胞 高爾基體期（Golgi）和 頭帽期（Cap ） 定位于細胞核和細胞漿，而頂體期（Acrosome ）定位于胞漿和頂體，最后在成熟期（Maturation）表達于精子尾部（圖2）。

圖1 免疫共沉淀檢測 GGNBP2與GGN相互作用

圖2 免疫熒光檢測GGNBP2 與GGN在精母細胞以及精子細胞4個期的共定位

三、Ggnbp2基因敲除對Ggn 基因 和蛋白表達以及定位的影響

分離30d和60d野生型和Ggnbp2KO小鼠睪丸生精細胞，PCR和Western blot結果提示Ggnbp2基因敲除小鼠生精細胞mRNA和蛋白表達均下降，且有顯著性差異（圖3）。

免疫組化結果提示GGN高表達于睪丸組織生精小管精母細胞核、精子細胞以及成熟精子的細胞核和細胞漿，而在Ggnbp2基因敲除睪丸生精小管，可見精子細胞數量明顯減少，而GGN主要表達于精母細胞細胞核（圖4）。

同時染色體細胞核分散免疫熒光進一步提示Ggnbp2基因敲除引起GGN表達局限于細胞核，胞漿染色熒光強度顯著減弱（圖5）。

圖3 Ggnbp2基因敲除對GGN基因和蛋白水平的影響

圖4 免疫組化檢測GGN在兩組睪丸生精小管中表達（×100）

討 論

GGNBP2，又被稱為DIF-3 或ZNF403，是鋅指蛋白家族進化過程中的一種保守蛋白，在睪丸中的表達水平遠高于其他組織，其生理功能與生殖過程密切相關。GGNBP2作為配子生成素（Ggn）的結合蛋白，后者是小鼠生殖細胞特異基因，其可變剪接產物配子生成素蛋白1（GGN1）、蛋白2（GGN2）和蛋白3（GGN3）在生殖細胞特定發育階段的特異性表達[10]。酵母雙雜交實驗證實GGNBP2 能夠與GGN1、GGNBP1以及OAZ3 相互作用，在精子發生過程中起決定作用[10,11]。我們用免疫沉淀進一步證實GGNBP2與GGN相互作用，形成蛋白復合體，參與精子發生。

既然 GGNBP2與GGN都高表達于睪丸組織，其在生精過程中定位情況如何。Jamsai等[12]研究發現GGN1蛋白表達最早出現在減數分裂粗線期精母細胞，并在圓精子細胞中高表達，其富含158個氨基酸序列的羧基結構域可與富含半胱氨酸的分泌蛋2（CRISP2）的離子通道調節區結合，共表達于精子尾部，提示可能精子的活動。Lu等更加明確了GGN的3個剪切體分別定位于核膜、胞漿和細胞核[10,13]。我們采用免疫熒光，觀察精母細胞以及精子細胞4個期（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2與GGN的定位改變，發現GGNBP2與GGN在精母細胞和精子細胞中定位完全吻合，且在精子細胞 Golgi和Cap 期 定位于細胞核和細胞漿，而Acrosome 期定位于胞漿和頂體，最后在Maturation期表達于精子尾部，這一發現也進一步提示GGNBP2與GGN一樣，同時參與精子的活動。此外，Jamsai等在他的另一項研究中報道了[14]GGN完全缺失引起胚胎移植前死亡，沒有存活囊，而Ggn雜合型敲除小鼠能存活，DNA雙鏈損傷修復受損，以此推測GGNBP2可能也參與DNA雙鏈損傷修復。

圖5 免疫熒光檢測Ggnbp2基因敲除對GGN在精母細胞定位變化

研究顯示小鼠POG蛋白（proliferation of germ cells）缺失引起原始生殖細胞缺陷，導致小鼠生精異常，精母細胞和精子細胞數量顯著低于正常[15]。而GGN能與POG蛋白相互作用，調控POG 蛋白定位[10]，在精子發生中起重要作用。基于上述研究，我們用Ggnbp2基因敲除動物模型，驗證基因缺失對GGN的mRNA和蛋白、以及細胞定位的影響。結果發現，Ggnbp2基因敲除能顯著降低GGN mRNA和蛋白水平，在未成年和成年小鼠均有抑制作用。我們前期實驗發現GGNBP2 mRNA水平在小鼠出生后14d開始升高，直到性成熟期都保持較高的水平，而且mRNA在精母細胞和精子細胞高表達，睪丸支持細胞低表達。而GGNBP2蛋白在精母細胞、精子細胞以及成熟精子均表達[8]。GGN免疫組化結果也證實GGN同GGNBP2定位一致，在精母細胞和精子細胞、成熟精子高表達，且主要表達于細胞核和細胞漿。Ggnbp2基因敲除，GGN主要定位于細胞核。染色體細胞核分散結合免疫熒光進一步證實Ggnbp2基因敲除引起GGN在精母粗線期、雙線期、終變期主要集中在細胞核，而且熒光強度明顯減弱。從而我們推測，Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷主要通過降低GGN表達，改變GGN細胞定位， DNA雙鏈損傷修復機制受損而引起。

我們下一步將圍繞GGNBP2如何引起DNA雙鏈損傷修復受損以及涉及的一些重要DNA損傷修復蛋白進行深入研究，進而揭示其導致生精功能障礙的機制。