禾谷鐮刀菌真菌毒素DON生物合成途徑及調控機制研究進展

侯 瑞， 金巧軍

(1.貴州大學林學院，貴州貴陽 550025； 2.西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100

小麥赤霉病是世界性病害，在亞洲、歐洲、北美洲等均有大流行的報道[1]。在我國，該病主要流行于長江中下游冬麥區、華南冬麥區、黃淮流域冬麥區、東北三江平原春麥區等，能夠造成全國范圍的大面積減產，是我國小麥的主要病害和重點防治對象。小麥赤霉病不但會造成小麥的嚴重減產，而且可在感病麥粒中產生大量的真菌毒素，不僅影響小麥的品質和質量，而且嚴重危害人、畜的健康[2]。真菌在生長極其緩慢、完全停止或遇到外界壓力的情況下可產生次生代謝產物——真菌毒素[3]。禾谷鐮刀菌是引起小麥赤霉病的主要病原菌[4]，其產生的真菌毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

(deoxynivalenol，簡稱DON)和玉米烯酮(zearalenone，ZEN)。單端孢霉烯族化合物(trichothecenes，簡稱TCTCs)分為類型A和類型B。類型A包含毒素T-2、HT-2、二乙酰蔗草鐮刀菌烯醇(diacetoxyscirpenol，簡稱DAS)等；類型B包含DON及其乙酰化衍生物(3Ac-DON/15Ac-DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(14-O-acetyl DON-4-nivalenol，簡稱NIV)等[5]。B型單端孢霉烯化合物類毒素能夠延緩或終止蛋白的生物合成[3]。ZEN是在禾谷鐮刀菌侵染玉米時檢測到的毒素，是唯一對人類來說比較溫和的真菌毒素[6]。單端孢霉烯族化合物和玉米烯酮的化學式見圖1。

1 禾谷鐮刀菌真菌毒素DON生物合成途徑

禾谷鐮刀菌中單端孢霉烯前體合成酶基因TRI5是DON生物合成第1步的關鍵酶。tri5基因敲除突變體致病力顯著下降，病害癥狀僅在接種的小穗處發生[7]，表明DON毒素的產生并不是初侵染所必須的，但對病原菌在穗部的擴展卻非常重要。在過去十多年中，參與DON生物合成的TRI基因都已被鑒定出。除了TRI101和TRI1～TRI16外，主要的TRI基因全都在一個TRI基因簇上(圖2)。其中，TRI6和TRI10基因調控所有TRI基因的轉錄，TRI6基因是主要的轉錄因子，TRI10基因起次要作用。TRI6可與TRI10的啟動子相結合并控制其表達，TRI6的表達是自我調控的[8]。TRI1、TRI4、TRI11基因都能編碼P450單氧合酶[9-11]；TRI3基因能夠進行C-15的乙酰化[12]；TRI7基因能編碼4-O-乙酰基轉移酶[13]；TRI8基因能夠進行C-3的脫乙酰化作用[14]；TRI12基因是單端孢霉烯族毒素輸出泵基因，能夠參與毒素的轉運[15]；TRI19基因的功能尚未知；TRI101基因編碼單端孢霉烯乙酰轉移酶[16](表1)。

2 真菌毒素DON生物合成的調控機制

目前，國內外對真菌毒素DON生物合成途徑的研究已經比較深入，對此途徑和次生代謝的總體調控是人們關注的重點。真菌毒素合成受到內因和外因2個方面的調控，即由外界環境因素和體內調控網絡的共同調控[17-18]。對于大多數真菌來說，某一類的環境因子，如pH值、碳源、氮源、H2O2等因子能夠和體內一些信號通路共同調節真菌毒素的合成[19-21]。

禾谷鐮刀菌中酸性pH值可誘導真菌毒素DON生物合成酶TRI5基因的表達，從而增強DON的生物合成。中性或堿性pH值條件下則不能合成DON，TRI基因的表達也檢測不到[22-23]。而pH值調控DON的合成是通過真菌體內高度保守的pH值調控系統完成的。pH值調控系統的核心為pH值代謝調節因子FgPAC1基因(FGSG_12970)，也是轉錄因子基因。敲除禾谷鐮刀菌中的FgPAC1基因可增強酸性條件下早期TRI基因的表達和增加DON生物合成量的積累。且主要的TRI家族調節基因TRI6和TRI10基因啟動子區都有潛在的FgPAC1基因的結合位點5′-GCCAAG-3′[23-24]。因此，在禾谷鐮刀菌中，FgPAC1基因反向調控TRI家族基因的表達和DON的生物合成。

表1 DON生物合成中心基因和功能

酵母和絲狀真菌中葡萄糖是優先碳源，會被優先吸收利用。只有在環境中沒有葡萄糖時，酵母和絲狀真菌才會使用其他碳源。如果優先碳源存在，就會抑制相關基因的轉錄和表達，即碳代謝抑制(carbon catabolite repression，簡稱CCR)[25]。禾谷鐮刀菌中，蔗糖能夠強烈誘導TRI4/TRI5基因的表達和真菌毒素DON的生物合成，但葡萄糖不能。同時，在蔗糖作為唯一碳源的培養基中額外加入葡萄糖，不能抑制DON的生物合成，說明CCR沒有參與DON的生物合成[26]。目前，禾谷鐮刀菌中也沒有關于CCR相關調節基因參與DON生物合成的相關報道。

胍基丁胺和精氨酸等氮源可強烈誘導禾谷鐮刀菌中TRI5基因的表達和真菌毒素DON的生物合成，但在相關誘導培養基中額外加入銨態氮則能抑制真菌毒素DON的生物合成[27-28]。銨態氮源是優先氮源，因此氮代謝抑制(nitrogen metabolite repression，簡稱NMR)參與了DON的生物合成。禾谷鐮刀菌中氮代謝抑制的調控中心為調節因子FgAREA基因(FGSG_08634)，也是轉錄因子基因，在銨態氮源缺乏時，FgAREA基因會被誘導表達，使次級碳源能夠被利用。敲除禾谷鐮刀菌中的FgAREA基因能夠抑制TRI5、TRI6、TRI10基因的表達，同時DON生物合成量大幅降低[28-30]。Hou等發現在禾谷鐮刀菌中，FgAREA基因能夠與TRI10基因直接互作，且主要的TRI家族基因啟動子區都有潛在的FgAREA基因的結合位點5′-HGATAR-3′(其中H代表A、T、C，R代表A或G)[28]。因此，在禾谷鐮刀菌中，FgAREA基因正向調控TRI家族基因的表達和DON的生物合成。參與氮代謝抑制的另一個調節因子FgNMR1基因(FGSG_07197)在銨態氮源充足時，能夠抑制FgAREA基因的表達。但敲除禾谷鐮刀菌中的FgNMR1基因，對DON生物合成并沒有影響。同時，Nasmith等發現禾谷鐮刀菌中TRI6基因也可以通過FgNMR1基因的表達來調控FgAREA基因[31]。

低濃度的H2O2能夠刺激禾谷鐮刀菌中真菌毒素DON的生物合成[32]。DON生物合成家族TRI基因的表達在禾谷鐮刀菌侵染小麥的早期能夠被檢測到[33]，而氧迸發是植物常見的防衛反應，因此禾谷鐮刀菌可能是把寄主產生的活性氧作為一個觸發器來刺激DON的生物合成，因為DON本身也是重要的植物性毒素和毒力因子[3]。禾谷鐮刀菌中，參與過氧化物壓力調控相關的轉錄因子基因為FgATF1(FGSG_10142)、FgSKN7(FGSG_06359)、FgYAP1(FGSG_08800)，雖然這3個基因都起著對氧分壓容忍的作用，但敲除FgATF1基因并不能夠影響DON的生物合成，敲除FgSKN7基因能夠降低DON生物合成量，而且降低了H2O2對TRI基因表達水平的誘導[34]，敲除FgYAP1基因能夠使DON生物合成家族TRI基因表達量升高，同時DON生物合成量大幅增加[35]。因此，在禾谷鐮刀菌中，FgSKN7基因正向調控TRI家族基因的表達和DON的生物合成，而FgYAP1基因反向調控TRI家族基因的表達和DON的生物合成。

禾谷鐮刀菌中，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，簡稱MAPK)、環腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A(cyclic adenosine phosphate-protein kinase A，簡稱cAMP-PKA)、雷帕霉素(target of rapamycin，簡稱TOR)等信號通路也都能夠調控真菌毒素DON的生物合成。MAPK信號通路能夠調節細胞的生長、分化和對環境的應激適應等多種重要的病理過程。禾谷鐮刀菌MAPK信號通路包含3個磷酸化途徑——Mgv1、Gpmk1、FgHog1磷酸化途徑。Mgv1磷酸化途徑的3個中心激酶基因[FgBck1(FGSG_06326)、FgMmk2(FGSG_07295)、FgMgv1(FGSG_10313)]被敲除后都會嚴重影響禾谷鐮刀菌侵染和產毒，突變體僅在接種點發病，幾乎檢測不到DON生物合成量[36]。破壞MAPK信號通路的Gpmk1磷酸化途徑同樣也能夠影響病原菌在小麥穗部的定殖和擴展[37]，Gpmk1磷酸化途徑的3個中心激酶基因[FgSte11(FGSG_05484)、FgSte7(FGSG_09903)、Fgpmk1(FGSG_06385)]被敲除后，DON生物合成量急劇降低[36-37]。FgHog1磷酸化途徑能夠調控滲透壓調節信號，參與FgHog1磷酸化途徑的中心激酶基因包括FgHOG1(Fg09612)、FgPBS2(Fg08691)、FgSSK2(Fg00408)，這3個基因的敲除突變體都能夠使DON生物合成量降低[38]。

cAMP-PKA信號通路能夠調控真菌的生長發育和致病機制[39]，禾谷鐮刀菌中編碼蛋白激酶A催化亞基的為FgCPK1(FGSG_07251)、FgCPK2(FGSG_08729)蛋白激酶基因。敲除FgCPK1基因，禾谷鐮刀菌真菌毒素DON生物合成量降低，但敲除FgCPK2基因，DON生物合成量并沒有明顯變化，敲除禾谷鐮刀菌中腺苷酸環化酶FgFAC1基因則不能合成DON[40-42]。當培養基中加入環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP)時，可以刺激TRI基因表達來誘導DON生物合成。額外加入cAMP并不能恢復tri6突變體的表型缺失，但卻能恢復tri10突變體在DON生物合成中的表型缺陷。cAMP的磷酸二酯酶基因為FgPDE1和FgPDE2。敲除FgPDE2基因可以激活蛋白激酶A(protein kinase A，簡稱PKA)的活性并增加DON的生物合成量，FgPDE1基因敲除突變體并沒有此功能。但雙突變體Fgtri6pde2菌株不能檢測到DON，雙突變體Fgtri10pde2菌株DON生物合成量顯著高于tri10單突變體，說明在 cAMP-PKA信號通路調節DON生物合成中，TRI6基因是必需的，同時，FgPDE2基因反向調節DON生物合成[43]。

TOR信號通路在營養物質信號轉導中起著重要作用[44]。但此信號途徑唯一的激酶基因FgTOR1/2(FGSG_08133)可能為致死基因[36]，與此激酶互作的Tap42磷酸激酶復合物由3個基因[FgPP2A(FGSG_09815)、FgSIT4(FGSG_01464)、FgPPG1(FGSG_05281)]編碼。其中，FgPP2A(FGSG_09815)基因不能被敲除，FgSIT4、FgPPG1基因可以被敲除。敲除FgSIT4基因不影響DON生物合成，但敲除FgPPG1基因后突變體中檢測不到DON[45]。

這些信號通路能夠影響真菌毒素DON生物合成量，說明它們參與調控了DON的生物合成。調控機制可能是唯一的，但絕大多數信號通路應該是把外界環境因子的信號傳導給體內的調控機制，從而實現對DON生物合成的總體調控。氮源調控DON生物合成調控中心轉錄因子FgAreA基因能夠影響Gpmk1的磷酸化水平及cAMP-PKA活性水平[28]。在TOR作用下，參與氮代謝的一些基因可以被誘導表達。同時，Audenaert等發現FgAREA和FgPPG1基因突變體在產孢率、致病性和DON生物合成量的表型方面都基本一致，可能因為FgAreA是FgPPG1的下游元件，共同參與了TOR信號途徑[32]。這些數據表明信號通路和代謝途徑應該是相互作用共同調控DON的生物合成。但目前氮代謝和信號通路的研究較多，其他代謝途徑的相關報道較少。

3 展望

禾谷鐮刀菌真菌毒素DON不僅能夠危害人、畜的健康，還是重要的致病因子，同時也是防治小麥赤霉病的關鍵。目前，還沒有關于控制禾谷鐮刀菌真菌毒素DON合成的有效途徑。傳統防治小麥赤霉病的手段以化學、物理方法為主，但防效甚微，還可能造成化學農藥污染。我國關于小麥赤霉病的抗病育種的工作開始的較晚，也沒有培育出較強的抗小麥赤霉病品種。因此，借助基因工程相關手段進行小麥赤霉病的防治極其重要，而搞清小麥赤霉病致病菌禾谷鐮刀菌真菌毒素DON的調控機制對防治小麥赤霉病的擴展和毒素的污染起著重要作用。可以通過控制禾谷鐮刀菌DON調控機制中的關鍵基因和關鍵信號通路來抑制禾谷鐮刀菌產生真菌毒素DON，從而控制禾谷鐮刀菌的進一步擴展，起到防治小麥赤霉病和提高糧食安全的作用。