加工番茄PVYN：O HC-Pro、STV RdRp酵母雙雜交誘餌載體的構建及自激活驗證

路 遙， 周 東， 鄭銀英

(石河子大學生命科學學院/石河子大學農業生物技術重點實驗室，新疆石河子 832003

新疆加工番茄病毒病日益嚴重，通過田間病毒檢測發現馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，簡稱PVY)和南方番茄病毒(southern tomato virus，簡稱STV)是造成新疆加工番茄病害的主要病毒，極大地減少了加工番茄的產量。馬鈴薯Y病毒是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的典型成員，根據寄主、生物學癥狀、基因組序列以及血清學特征可將PVY分為普通株系(common or ordinary strain)PVYO、煙草葉脈壞死株系(tobacco veinal necrosis strain)PVYN、馬鈴薯點刻條斑株系(potato stipple streak strain)PVYC、PVYZ以及PVYO和PVYN的重組株系PVYNTN、PVYN：O和PVYN-Wi[1]。梁學超等通過血清學檢測發現，新疆加工番茄上PVYO、PVYO/N/C、PVYN檢出率分別為20%、18.05%、0，且PVY不同株系總檢出率達到24.9%，表明新疆加工番茄上PVY主要為PVYN：O株系和PVYO株系[2]。PVY為單鏈正義RNA病毒，只包含1個開放閱讀框(ORF)，翻譯成1個大的多聚蛋白，再利用蛋白酶將其加工成11個多功能蛋白(P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP)[3-4]。HC-Pro 是馬鈴薯Y病毒重要的多功能蛋白，可以影響病毒生活史的多個方面，它具有HC-Pro/P3特異切割位點識別功能，在病毒基因組翻譯、蛋白加工中發揮重要作用，同時參與病毒的復制和癥狀表達，促進病毒在植物體內細胞間移動和系統移動，抑制轉錄后基因沉默和病毒誘導的基因沉默[5-6]。南方番茄病毒是一種雙鏈RNA(dsRNA)病毒，其基因組核苷酸序列全長為3 437 nt，含有2個部分重疊的開放閱讀框，推測ORF1編碼377個氨基酸的外殼蛋白(CP)，而ORF2編碼762個氨基酸的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)[7-9]。STV為種傳病毒，尚未發現其他傳播機制，目前，對于STV的研究還處于初期階段，對于其侵染番茄植株的分子機制及侵染癥狀尚不了解。酵母雙雜交系統是植物病毒學研究中的重要手段，主要應用于病毒蛋白與寄主編碼蛋白相互作用的研究，可以通過酵母雙雜交系統篩選與PVYHC-Pro和STVRdRp基因相關的加工番茄內源基因。由于酵母雙雜交系統可能出現假陽性現象，所以需要進行誘餌載體自激活試驗，本研究利用以Sos恢復系統(一種不依賴轉錄激活機制的酵母雙雜交系統)為原理的胞質酵母雙雜交系統，構建PVYHC-Pro和STVRdRp基因的誘餌載體，并在酵母中進行自激活檢測及毒性分析，為從加工番茄cDNA文庫中篩選與PVYHC-Pro和STVRdRp互作的寄主因子以及研究PVY和STV的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及試劑 溫度敏感酵母突變株cdc25H、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α為筆者所在實驗室保存。質粒pSos、pSos MAFB、pMyr MAFB、pMyr LaminC、pSos ColⅠ、pMyr SB，均購自Stratagene公司；T4DNA連接酶及PCR產物回收試劑盒均購于Promega公司；試驗所需內切酶購自Fermentas公司；氨基酸、酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 基因與引物 根據筆者所在實驗室已獲得的PVY[2]和STV基因組全長序列設計引物，結合酵母表達載體pSos的閱讀框和多克隆位點，在PVYHC-Pro上下游引物的5′端分別引入BamHⅠ/SalⅠ酶切位點，在STVRdRp上下游引物的5′端分別引入SalⅠ/SacⅠ酶切位點(表1)。引物合成和序列測定均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 以筆者所在實驗室已經克隆、測序的pGEM-T-PVY HC-Pro及pGEM-T-STV質粒DNA為模板，利用引物HC-Pro F/HC-Pro R、RdRp F/RdRp R分別擴增HC-Pro和RdRp，擴增結束后，將5 μL PCR產物進行電泳，對剩下的擴增產物進行回收。

1.2.2 克隆載體和誘餌載體的構建與鑒定 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后與pGEM-T載體于4 ℃過夜連接。將連接產物轉化EscherichiacoliDH5α，37 ℃過夜培養，挑取單菌落，37 ℃搖菌16 h，提取質粒DNA，雙酶切鑒定正確的克隆載體進行測序。將測序正確的重組質粒pGEM-HCPro、pGEM-RdRp分別用BamHⅠ/SalⅠ、SalⅠ/SacⅠ雙酶切，同時用相同的酶消化酵母誘餌載體pSos，回收目的片段，用T4DNA連接酶于4 ℃連接過夜，構建pSosHC-Pro、pSos-RdRp載體。

表1 試驗所用的引物及序列

注：下劃線表示在相應引物5′端引入酶切位點的序列位置。

1.2.3 酵母菌株cdc25H表型的驗證 將Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit中的酵母菌株cdc25H劃線于YPAD平板，分別于25、37 ℃孵育6 d，同時將酵母菌株cdc25H在4種單營養缺陷型[尿嘧啶缺陷型(Ura-)、亮氨酸缺陷型(Leu-)、色氨酸缺陷型(Trp-)、組氨酸缺陷型(His-)]SD/Glu培養基(指含有葡萄糖的SD培養基)平板上劃線，在25 ℃下培養6 d，觀察結果。

1.2.4 共轉化及誘餌蛋白轉錄自激活活性的檢測 將表2的不同質粒組合分別加入酵母感受態細胞中并混勻，再按照Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit所提供的方法進行共轉化與激活作用檢測試驗。分別將10、100 μL轉化酵母菌液涂布于SD/Glu (-UL)平板上，于 25 ℃ 培養 5 d，計算酵母感受態細胞轉化效率，并將剩余轉化酵母菌液1(對應表2中的第1組)涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于 37 ℃ 培養6 d，觀察是否發生溫敏回復。分別將轉化酵母菌液2～9(對應表2中的第2～9組)涂布于SD/Glu(Leu-、Ura-、-UL)平板上，25 ℃培養5 d后，隨機挑取3個單菌菌落，分別用25 μL無菌水混勻，再分別取 2.5 μL 菌液劃線于2個 SD/Glu(-UL) 和2個SD/Gal(-UL)平板上，每種平板分別放置于25、37 ℃下培養5 d，觀察溫度對菌落生長的影響。

表2 誘餌蛋白和對照檢測質粒共轉化組配

注：“-UL”指缺失尿嘧啶、亮氨酸2種氨基酸。下同。

2 結果與分析

2.1 克隆載體與誘餌載體的構建及鑒定

通過PCR擴增、克隆獲得1 398 bp PVYHC-Pro和2 286 bp STVRdRp基因，并將相應的目的片段連接pSos，成功構建pSosHC-Pro和pSos-RdRp載體(圖1)。

2.2 酵母菌株cdc25H表型的驗證

將酵母菌株cdc25H在YPAD平板上劃線，分別在25、37 ℃ 培養6 d。在25 ℃時菌落生長正常，在37 ℃時無菌落生成。同時，將酵母菌株cdc25H在4種單營養缺陷型(-Ura、-Leu、-Trp、-His)SD/Glu平板上劃線，于25 ℃培養6 d，結果在4種單氨基酸營養缺陷型的平板上均不生長。結果表明，酵母菌株cdc25H表型正常，沒有發生溫度敏感回復突變，可用于后續試驗。

2.3 酵母感受態細胞的制備和轉化效率的計算

取75 μL酵母感受態細胞涂布于YPAD平板上，于37 ℃孵育 6 d 后發現沒有出現酵母菌落，表明未發生溫度敏感回復突變，可用于后續試驗，根據表2中轉化酵母菌液1可計算出酵母感受態細胞的轉化效率為6.14×103/μg，將剩余轉化酵母菌液1涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于37 ℃孵育6 d，未發現酵母菌落生長，表明沒有溫敏回復發生，說明所制備的酵母感受態可用于酵母雙雜交試驗。

2.4 誘餌蛋白自激活作用的檢測

將測序后證明構建正確的誘餌載體pSosHC-Pro及pSOS-RdRp按照表2中的配比轉入制備好的cdc25H酵母感受態細胞后，發現25 ℃時均能夠在SD/Glucose(-UL)平板上正常生長，分別隨機挑取3個單菌落分別劃線于2個 SD/Glu(-UL) 和2個SD/Gal(-UL)平板上，每種平板分別放置在25、37 ℃下培養5 d，對于誘餌蛋白pSosHC-Pro及 pSos-RdRp，在25 ℃時每種組合在SD/Glu(-UL)和SD/Gal(-UL)平板上均能生長，現象正常；在37 ℃時SD/Glu(-UL)平板上均不生長，在SD/Gal(-UL)平板上①、③、⑤生長現象正常，結果表明誘餌蛋白pSos-HcPro及pSOS-RdRp沒有自激活作用(圖2)，因此可見2種誘餌載體適用于該酵母雙雜交系統，可以進行后續的cDNA文庫篩選。

3 討論

新疆由于水土光熱資源豐富，使得加工番茄成為該地的主要經濟作物。近年來，由于受栽培模式及氣候等客觀因素的影響，使得病毒病得以蔓延。通過對新疆加工番茄田間病毒檢測發現，新疆加工番茄病毒病主要有CMV、ToMV、PVY、STV，這表明STV也已成為加工番茄種植不容忽視的主要病毒[10-11]。本研究將PVY、STV作為新疆加工番茄主要原有病毒以及新興的主要病毒，研究PVY、STV與加工番茄的相互作用以及揭示其致病機制尤為重要。

酵母雙雜交技術是在真核細胞調控轉錄中進行的一種高效敏感的研究蛋白與蛋白之間相互關系的技術[12]。近年來，酵母雙雜交技術已成為植物病毒學研究中的主要手段，廣泛應用于研究植物病毒蛋白與寄主編碼蛋白之間的相互作用，大量應用于篩選與已知蛋白的候選互補蛋白或驗證蛋白間相互作用方面[13-14]。研究認為，HC-Pro在病毒侵染過程中起至關重要的作用，利用酵母雙雜交系統篩選加工番茄中與PVY HC-Pro互作的寄主因子，將有可能從加工番茄中分離鑒定出參與病毒沉默的寄主因子基因，有助于加工番茄防治病毒病的研究。STV作為新興的加工番茄主要病毒，其侵染加工番茄的分子機制尚不清楚，利用酵母雙雜交系統篩選與 STV-RdRp互作的寄主基因，將有可能弄清STV侵染植物的機制，為研究STV提供基礎。

在利用酵母雙雜交系統篩選文庫驗證及蛋白質間相互作用的過程中，誘餌蛋白的正確表達至關重要，一方面由于某些蛋白的表達可能會對酵母菌株有毒害作用，使其不能夠在選擇培養基上進行生長，影響后續篩選工作，另一方面某些誘餌蛋白本身就具有轉錄自激活活性，這些蛋白能夠激活報告基因，使其能夠表達，造成假陽性現象，因此，要進行誘餌載體的自激活和毒性驗證，以此排除假陽性和假陰性現象。本研究構建了PVYHC-Pro和STV-RdRp基因的誘餌載體，通過研究顯示這2個誘餌載體均無毒性或自激活作用，因此，構建完成的誘餌載體符合本試驗的需要，為下一步從加工番茄cDNA文庫中篩選與HC-Pro和RdRp相互作用的蛋白奠定了基礎。