煙葉多酚含量與相關基因表達間的關系分析

張 敏， 顧 勇， 張永輝， 趙錦超， 彭 勇， 徐傳濤， 謝 強， 夏建華， 張軍杰， 魯黎明

(1.四川農業大學農學院，四川成都 611130； 2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川瀘州 646000

多酚類物質是植物重要的次生代謝物質之一，主要由苯丙氨酸代謝途徑合成。苯丙氨酸代謝主要包括苯丙烷代謝和類黃酮合成2個途徑，其中，苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)在苯丙烷類化合物代謝中具有中心酶的作用，可以催化L-苯丙氨酸分子脫氨生成反式肉桂酸反應[1]。煙草的PAL由2～4個獨立基因編碼[2]，其基因的表達受外界環境的影響較大。在正常生長情況下，煙草PAL基因表達較弱；而當遭受外界環境脅迫時，PAL基因會增強表達[3]。研究表明，在感染煙草病毒時，煙株中的PAL基因的表達量顯著增高[4]。用茉莉酸甲酯(MJ)處理煙草時，煙草幼苗的PAL活性明顯提高，其抗病性明顯增強[5]。

肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)是細胞色素P450單加氧酶中的一種，在苯丙烷類代謝途徑中同樣具有關鍵作用，是該途徑中的第2個關鍵酶[6]。C4H是植物中分布最廣的主要P450之一，在植物各部位都有很高活性。該酶活性的高低，也影響著植物多酚類物質的合成。楊慧芹等研究表明，干旱和低溫脅迫下，煙草中C4H的活性和基因表達量與總酚和木質素含量的變化趨勢一致[3]。而在煙草C4H的表達受干擾時，煙草木質素的含量就會降低[7]。

煙草中的多酚物質種類和數量較多，一般來說，以綠原酸和蕓香苷居主要地位。這些多酚類物質，除了在煙草的防御反應中發揮重要作用外，亦是香氣物質的重要成分之一[8]。植物多酚類化合物降解所生成的物質，能賦予煙草制品典雅的香氣，并增強其香氣品質，極大地影響著烤煙的感官質量[9-11]。

盡管多酚類物質對烤煙的生長發育及品質影響巨大，然而，目前的研究主要集中在酚類物質含量的區域差異分析方面，缺少從基因表達的角度對苯丙烷代謝關鍵基因的表達與酚類物質含量之間關系進行探尋的研究[12]。因此，本研究以四川各個烤煙產區烤煙為研究對象，分析煙葉的多酚含量與PAL及C4H基因的相對表達量之間的關系，以期為烤煙酚類物質代謝的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

本研究試驗材料為烤煙品種云煙87和紅花大金元(以下簡稱紅大)。試驗于2015年在四川省6個具有代表性的烤煙生產縣進行，試驗點具體位于攀西地區的冕寧縣回龍鄉新堡子村、西昌市黃水鎮雙龍村、會理縣南閣鄉南山村、仁和區平地鎮大村、米易縣普威鎮街村、川南地區的古藺縣觀文鎮小屯村。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括上海佑科公司的UV755B紫外分光光度計、CT15RT臺式高速冷凍離心機、BIO-BAD S1000 PCR儀、BIO-BAD電泳儀、BIO-BAD成像儀、Agilent公司1100高效液相色譜儀、SPD-10AVP紫外檢測器、烘箱等。

主要試劑：硼酸、鹽酸、巰基乙醇、EDTA、抗壞血酸鈉等均為國產分析純；RNA提取用Trizol試劑盒等均購買于寶生物工程(大連)有限公司；反轉錄用Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 鮮煙葉及烤后煙葉的采集 試驗選取土地平整、灌排方便的地塊。試驗地面積為667 m2，平均分為2塊，分別種植云煙87與紅大。試驗地煙葉的栽培管理按當地的優質煙葉栽培規程進行。試驗所選取的煙樣分為鮮樣和干樣，其中鮮樣在烤煙旺長期、打頂期和成熟期進行采集，干樣為烤后煙葉樣品，在煙葉調制后采集。

鮮樣采集：在烤煙各生育期時期，于晴朗天氣上午按“S”形取樣方法，選取30株長勢基本一致無病蟲害正常煙株，采集中部煙葉(從下往上數第10張煙葉)。將采集后的煙葉迅速沿主脈分開，一半在液氮中速凍，帶回實驗室后凍存于-80 ℃ 冰箱，用于基因表達水平測定；另一半先于105 ℃殺青30 min，然后于60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，用于多酚類物質的測定。

干樣采集：在各試驗點采集烤后煙葉中的C3F等級煙葉各1 kg，于40 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩備用。

1.3.2 多酚類物質的測定 采用福林法測定待測煙葉樣品中的酚類物質，具體參照王瑞新等的方法[13]進行。

1.3.3PAL及C4H基因表達量的檢測 采用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(real-time quantitative PCR detecting system，簡稱qPCR)的方法檢測各待測樣品中的PAL及C4H基因相對表達量。樣品總RNA的提取通過Trizol法進行，具體參見魯黎明等的方法[14]進行。cDNA第1條鏈的合成，按照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒的操作說明進行。引物設計及PCR擴增：引物的設計，參考美國國立生物技術信息中心(NCBI)GeneBank數據庫中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的基因CDS序列進行。所設計的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增所用引物序列

qPCR擴增：以反轉錄合成的cDNA為模板，加入表1中的相應引物及其他反應試劑進行qPCR擴增。反應體系：2×SYBR Premix ExTaqⅡ5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 2 μL，總體積10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 不同產區煙葉多酚含量的比較

酚類物質是煙草中重要的次生代謝產物，同時，煙葉中酚類物質的含量對烤后煙葉的外觀質量和香吃味均有著良好的影響。本研究對烤煙不同生長階段及烤后煙葉的多酚含量進行了分析，結果見表2。由表2可知，對同一烤煙品種而言，其煙葉中多酚的含量隨著生育進程的遞進而增加。在成熟后期，煙葉中的多酚物質積累較快，烤后煙葉中多酚的含量達到最高。同一地區不同烤煙品種的多酚含量不同，其基本趨勢為紅大高于云煙87。這種趨勢在各個生育時期均表現相同，尤其在烤后煙葉中，紅大的多酚含量遠高于云煙87。一般認為，紅大的香氣質與香氣量均好于云煙87，從本研究結果來看，紅大的多酚含量較高，可能是其中的原因之一。無論在旺長期、現蕾期、成熟期還是在烤后煙葉中，同一品種烤煙在不同地區中多酚總量存在顯著性差異。對于烤后煙草而言，云煙87煙葉多酚含量最高的地區為冕寧，最低的為古藺；而紅大煙葉中多酚含量最高的地區為米易，最低的為會理。

表2 四川烤煙不同品種不同生育期煙葉多酚含量比較

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。表3、表4同。

2.2 不同產區不同生育期煙葉PAL、C4H基因的相對表達量

烤煙苯丙氨酸解氨酶(PAL)與肉桂酸-4-羥化酶(C4H)是多酚類物質合成的2個關鍵酶。因此，分析它們在不同品種及不同生育期的基因表達情況，對于理解煙葉中多酚類物質的含量差異至關重要。由表3、表4可知，PAL、C4H基因的相對表達量在各個生長期都存在明顯不同。對PAL基因而言，同一品種烤煙其相對表達量總體隨著生育進程的增加呈現下降趨勢，到成熟期達到最低。同一品種不同地區間，PAL基因的相對表達量差異顯著，但地區間表現的規律性并不強。紅大成熟期PAL基因表達較高的地區為古藺、會理及米易，與這些地區煙葉中的多酚含量較高(表2)相呼應。此外，就紅大與云煙87品種來看，在成熟期，古藺、西昌、會理紅大的PAL基因表達量相對較高。

表3 四川烤煙品種與地區間PAL基因相對表達量差異

表4 四川烤煙品種與地區間C4H基因相對表達量差異

肉桂酸-4-羥化酶(C4H)是多酚代謝中第2個關鍵酶，C4H基因在不同地區、不同品種及不同生育期的相對表達量見表4?？傮w來看，C4H在不同品種、不同地區的各時期表達量都存在很大差異，趨勢表現沒有明顯的規律性。同一地區不同品種間，成熟期煙葉中的C4H基因表達量有較大的差異。就紅大而言，古藺、冕寧、西昌、米易4地煙葉中C4H基因的表達量相對較高，與這4地中烤后煙葉的多酚含量較高較為吻合。對云煙87來說，C4H基因在古藺和米易2個地區相對表達量比較低，而在冕寧和會理2個地區相對表達量較高。從多酚含量分析的結果來看(表2)，冕寧和會理2個地區煙葉的多酚類物質含量高，而古藺與米易2個地區煙葉的多酚類物質含量就相對較低。這說明C4H基因的相對表達量也與烤后煙葉中多酚類物質的含量密切相關。

基因相對表達量分析結果表明，基因表達的不同可能會影響到相應酶變化，并最終將使得該代謝途徑代謝產物的變化，從而導致煙葉中多酚含量的不同。

2.3 PAL及C4H基因表達量與煙葉中多酚含量的相關性分析

采用qRT-PCR的方法，測定烤煙旺長期、現蕾期及成熟期的PAL及C4H的基因表達量，并將其與烤后煙葉的多酚含量進行相關性分析。由表5可知，總體來看，烤后煙葉中多酚的含量與PAL及C4H基因在成熟期的表達量密切相關。對PAL基因而言，云煙87相關性在成熟期達顯著水平；紅大在各個時期的相關性均不顯著，甚至呈負相關。C4H的相關性表現明顯，成熟期2個品種的相關性均達極顯著水平；旺長期云煙87的表達量與多酚含量呈顯著正相關，現蕾期紅大則呈顯著負相關。由此說明，煙葉成熟期PAL、C4H基因的表達量與烤后煙葉的多酚含量有著十分緊密的聯系，可能是決定煙葉多酚含量的關鍵時期。

表5 烤后煙葉多酚含量與PAL、C4H基因表達量的相關性

注：“*”“**”分別表示基因表達量與烤后煙葉中多酚含量顯著相關、極顯著相關。

3 討論與結論

本研究分析了烤后煙葉中多酚含量與PAL、C4H基因表達量的關系，結果表明，這2個基因在煙葉成熟期的表達量與多酚含量密切相關。

多酚類物質是植物的一種重要的次生代謝物質，在植物的生長發育及抵御逆境方面發揮著十分重要的作用[9-10]。對于煙草而言，多酚類化合物與煙葉品質有密切關系，也是煙草品質高低的衡量指標之一[11]。煙草中的多酚類物質主要通過酶促反應、棕色化反應等影響煙氣生理強度、煙葉色澤和香味[15]。煙草多酚主要包括蕓香苷與綠原酸，其中，綠原酸是一種二羧酯，本身具有弱的清香味[16-17]，經過酶促反應可以生成吡咯、吡啶、吡嗪類物質，這些物質對煙葉的色澤和香味均有重要的作用[11]。同時，烤煙調制過程中所發生的棕色化反應直接影響了煙葉的顏色[9]。此外，煙草燃燒時，多酸類化合物發生酸性反應可以中和堿類，使得煙草吸味醇和[15]。

多酚類物質由苯丙烷代謝途徑產生，PAL、C4H、4CL是該合成代謝途徑中的關鍵酶[13]。煙草的PAL由2～4個獨立基因編碼[2]。肉桂酸羥化酶是植物中分布最廣的主要P450之一，C4H的顯著特點是在植物各部位都有很高活性。肉桂酸羥化酶是第1個被鑒定的植物P450單加氧酶[18]，也是第1個既被克隆又確定了功能的植物P450。迄今，許多植物的C4H基因已被分離[19]。如駱萍等研究參與棉酚合成的P450單加氧酶時，就分離得到2個C4H同源cDNA克隆CYP73A25、CYP73A26[20]。

研究表明，PAL、C4H、4CL等基因表達量的高低，除了與煙草的生長發育有關外，還與烤煙抵御不良環境密切相關[4-5，7，12，21]。本研究中，煙草的多酚隨著生育進程而逐漸積累，到成熟期達到最高。同時，PAL、C4H的表達量在不同生育期也不同。相關性分析的結果表明，煙草多酚的含量與成熟期PAL、C4H的表達量有著十分緊密的聯系。Williamson等研究表明，PAL、C4H、4CL等基因表達量高的品種，其當代及后代的多酚含量也高[21]。本研究的結果既印證了Williamson等的結果，又做了進一步的補充，即成熟期PAL、C4H的表達量才是決定煙葉中的多酚含量高低的關鍵因素。

此外，本研究的結果還說明，不同烤煙品種的PAL、C4H的表達模式并不相同。如PAL的表達量與烤后煙葉的煙堿含量呈負相關，而C4H的表達量與煙堿含量則呈正相關。其中的原因是否與PAL、C4H在苯丙烷代謝途徑中的作用有關，尚有待于研究。

烤煙是我國重要的經濟作物。多酚類化合物及其分解產物與煙草的等級及香味有關，是煙草的一種重要品質標志物。因此，未來的研究應從分子生物學的角度，對編碼苯丙烷代謝途徑中關鍵酶的基因的功能進行深入的研究，明確其在苯丙烷代謝調控中的作用，以為進一步調控煙草多酚物質的合成以及提高煙草的品質奠定基礎。