西瓜枯萎病苗期抗性鑒定及抗源篩選

李曉慧， 梁 慎， 常高正， 徐小利， 康利允， 高寧寧， 趙衛星

(河南省農業科學院園藝研究所，河南鄭州 450002

西瓜枯萎病是一種世界性瓜類土傳病害[1-2]，由尖孢鐮刀菌西瓜?；筒≡?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)引起，對西瓜產量和品質構成了嚴重的威脅，是西瓜生產上的主要病害，而且連作加重了枯萎病的發生，嚴重影響了西瓜的產量和品質[3]。由于該病原菌可以形成厚垣孢子以抵御外來侵害，目前尚缺乏安全有效的化學手段來防治該病害[4]。選育抗病品種是防治西瓜枯萎病最經濟有效的方法[5]，雖然目前還沒有發現具有高度抗病性的品種用于防治西瓜枯萎病，但尋找抗源仍是育種學家和植物病理學家的重要工作目標。近年來，有關西瓜枯萎病抗性鑒定的研究多集中在枯萎病病菌生理小種鑒定、接種方法、不同品種抗病性的篩選等方面[6-9]，而關于室內快速鑒定技術方面的系統研究鮮有報道。因此，本試驗對影響枯萎病苗期鑒定的接種方法、接種濃度、栽培土質、培養容器等進行系統篩選與比較，并對現有的部分西瓜材料進行抗性篩選，以期建立一套快速、準確、簡便、實用的西瓜枯萎病苗期抗性鑒定技術體系，篩選出抗枯萎病的種質資源，為西瓜抗枯萎病育種技術研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試抗性鑒定西瓜品種為F365，是感病品種，由河南省農業科學院園藝研究所提供。供試西瓜種質材料為40份不同來源的西瓜自交系材料，均由河南省農業科學院園藝研究所西甜瓜課題組提供。供試病原菌材料為西瓜枯萎病病菌1號生理小種，由河南省農業科學院園藝研究所西甜瓜課題組保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 分生孢子培養及其孢子液制備 試驗于2015年在河南省農業科學院園藝研究所分子生物學實驗室進行，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato deatrose agar，簡稱PDA)培養基(配方：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL自來水)平板上接種西瓜枯萎病病菌1號生理小種，在28 ℃條件下培養15 d，制備分生孢子液，通過顯微鏡和血球計數板觀察和計算，配制成分生孢子濃度分別為102、103、104、105、106、107個/mL 的孢子液備用。

1.2.2 抗病性鑒定方法的篩選 接種方法：(1)傷根灌根法，在子葉展平時，將西瓜幼苗剪去部分側根，栽種到培養瓶中，加入適量無菌水和30 mL分生孢子濃度為105個/mL的孢子液；(2)直接灌根法：在子葉展平時，將洗凈的西瓜苗栽種到培養瓶中，加入適量無菌水和30 mL分生孢子濃度為105個/mL的孢子液；(3)傷根蘸孢法：在子葉展平時，將西瓜幼苗剪去部分側根，浸入分生孢子濃度為105個/mL的孢子液中 10 min，然后栽種到培養瓶中，加適量無菌水；(4)土壤拌菌法，將30 mL分生孢子濃度為105個/mL的孢子液與基質混勻，放入培養瓶中，在子葉展平時，移栽西瓜幼苗。

接種濃度：設計分生孢子102、103、104、105、106、107個/mL 等6個濃度進行接種處理。

栽培土質：分別以在121 ℃條件下滅菌60 min后的草炭土、高產土(常年種植蔬菜的大田土壤)、低產土(未種植過農作物的土壤)、珍珠巖等為基質，移栽西瓜幼苗。

培養容器：采用經高壓滅菌后的培養皿(直徑為150 mm，高度為 20 mm)、營養缽(直徑為10 cm，高度為10 cm)、組織培養瓶(底面積為78 cm2，高度為15 cm)進行幼苗培養。

除各項單因子研究按照設計的方法進行外，其余均按以下方法進行：采用傷根蘸孢法進行接種，分生孢子接種濃度為 105個/mL，定植于裝有經過滅菌的草炭土的培養瓶中，放在25～28 ℃ 條件下培養，所有處理均設3次重復，每次重復30株苗，接種20 d后觀察并記錄西瓜枯萎病的發生率。

1.2.3 西瓜種質資源抗枯萎病鑒定 采用本研究建立的西瓜枯萎病苗期抗性鑒定技術對40份西瓜育種材料進行人工接種抗病性鑒定。每個處理均設3次重復，每次重復30株苗。接種20 d后觀察并記錄西瓜幼苗枯萎病發生情況，按下列公式計算枯萎病的病情指數(DI)：

病情指數=100×∑(各級病株數×各級代表值)/(調查總株數×最高級代表值)。

病級分類方法參照文獻[10]，0級：無癥狀；1級：晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫，夜間能恢復；2級：1個真葉萎蔫或子葉萎蔫較嚴重；3級：子葉及60%以上真葉萎蔫，阻礙發育；4級：整株萎蔫，60%以上植株枯死，心葉成活；5級：植株嚴重萎蔫并枯死。

抗性分級標準參照文獻[11]，高抗(HR)：DI≤10；抗病(R)：1070。

2 結果與分析

2.1 抗病性鑒定方法篩選

2.1.1 不同接種方法對病菌致病性影響 由圖1可知，傷根蘸孢法接種導致西瓜枯萎病發病快，接種20 d后發病率為76.7%，土壤拌菌法接種效果次之，接種20 d后發病率為 66.7%；而其他2種接種方法(直接灌根法和傷根灌根法)發病較緩慢且輕，接種20 d后發病率均低于20%。表明4種接種方法均能導致西瓜枯萎病的發生，但傷根蘸孢法接種發病迅速、均勻，可大大縮短西瓜枯萎病的病程，這可能與該接種方法可使病原菌與西瓜根系直接接觸有關。

2.1.2 不同土質對病菌致病性影響 由圖2可知，利用草炭土、高產土作為栽培土質，西瓜幼苗枯萎病的發病率較高，分別為86.7%、76.7%，均顯著高于以低產土、珍珠巖作為栽培土質時的枯萎病發病率。由些可見，土壤肥力越大，發病越嚴重，其原因可能是草炭土、高產土的肥力較高，能提供病原菌用以繁殖的能量，進而加快對西瓜幼苗的侵染。因此，在試驗中，為使西瓜幼苗準確快速發病，建議采用草炭土作為栽培土質。

2.1.3 不同培養容器對病菌致病性影響 由圖3可知，培養瓶中的西瓜幼苗發病率最高，為83.3%，顯著高于其他2種培養容器；培養皿和營養缽之間的發病率差異不顯著。這可能與培養容器的保濕性有關，培養瓶能使病原菌處在高濕條件下，保證枯萎病在短期內發病均勻、迅速，更好地發揮該方法快速鑒定的優勢。

2.1.4 不同接種濃度對病菌致病性影響 由圖4可知，隨菌液接種濃度的增加，西瓜枯萎病的發病率呈現先上升后下降的趨勢，當枯萎病病菌分生孢子濃度為105個/mL時，枯萎病的發病率最高，為90.0%，其發病程度與分生孢子濃度為106、107個/mL之間差異不顯著，但三者均顯著高于其他3個濃度。因此，采用傷根蘸孢法接種時，建議采用枯萎病病菌的分生孢子濃度為105個/mL。

2.2 西瓜種質資源抗枯萎病鑒定

采用篩選出的鑒定方法對40份西瓜材料資源進行抗枯萎病鑒定，由表1可知，所測40個西瓜育種材料中沒有高抗枯萎病的種質資源，但它們對枯萎病的抗性分化非常明顯，其中抗病材料有2份、中抗材料有13份、感病材料有18份、高感材料有7份，分別占鑒定資源的5.0%、32.5%、45.0%、17.5%。這與在田間病圃的自然發病程度基本一致，說明鑒定結果準確有效。

3 結論與討論

抗枯萎病鑒定是西瓜育種的一個關鍵環節，苗期鑒定一直是抗枯萎病鑒定的一個重要組成部分，可使育種工作者及時了解育種材料的抗感性。而西瓜在田間苗期一般不發生枯萎病或發病較輕，如何有效接種并使西瓜幼苗發病，一直是影響抗病性鑒定成功與否的關鍵問題。目前，國內外在葫蘆科作物枯萎病苗期接種鑒定中采用的方法主要有蘸孢法(浸根法)、菌土法、灌根法、蘸胚根法等。雖然土壤拌菌法比較符合自然發病，但在實際操作中往往出苗不均勻或發病較輕[12]；蘸胚根法操作簡便，但在接種后潛育期較長，一般為 8～9 d[13]；灌根法存在發病率較低、穩定性較差等缺點[14]。因此，蘸孢法(浸根法)在國內外使用最為廣泛，其潛育期為 4 d 左右，且發病率較高[15]。本研究比較了4種西瓜枯萎病苗期接種方法，篩選出傷根蘸孢法為西瓜枯萎病接種的最佳方法，該方法在浸根接種方法的基礎上，對西瓜幼苗進行了剪根處理。結果表明，通過剪根可以控制傷根的均勻程度，保證檢測結果更接近寄主本身的特性。該方法具有發病快而整齊、結果穩定的特點，供試材料對枯萎病的抗性與田間實際情況基本吻合。

表1 不同西瓜種質資源對枯萎病的抗性測定

接種濃度也是影響枯萎病抗性鑒定準確性的重要因子之一[12]。孢子濃度過低，幼苗表現為抗性較強、發病較輕、病情指數較低，且發病潛育期長，延長了鑒定周期[16]。接種孢子濃度過高，則會增加孢子培養和孢子液制備的工作量，浪費人力和物力。本試驗結果表明，所用枯萎病病菌的分生孢子濃度為105個/mL時，能保證枯萎病在短期內發病均勻、迅速，且其發病率顯著高于分生孢子濃度≤104個/mL時的發病率，這與王喜慶等的研究結果[10]一致。

枯萎病是一種土傳性病害，土壤因子條件的變化與病害的發生程度有著直接的關系。Wheeler等就田間土壤溫度、土壤濕度等條件對田間自然存在的枯萎病病原菌侵染植物的影響進行研究，結果表明，枯萎病的發生隨土壤類型、土壤干燥時間的變化而變化[17]。本研究發現，當以草炭土、高產土作為栽培土質時，西瓜幼苗枯萎病的發病率較高；而李倫光的研究則認為，隨著土壤中速效鉀、速效磷含量的減少，枯萎病的發病程度呈上升趨勢[18]。這可能與枯萎病的發生還受土壤含水量、pH值、土壤孔隙度等條件的制約有關，但具體原因還有待進一步研究。本研究還發現，采用保濕效果較好的培養瓶作為培養容器，枯萎病的發病率較高，這與劉朋義對甜瓜抗枯萎病鑒定的研究結果[19]一致。

我國是世界上種植西瓜面積最大的國家。近年來我國西瓜栽培面積迅速擴大，西瓜連作造成枯萎病發生越來越普遍、嚴重。大量研究表明，西瓜枯萎病抗性的遺傳是受單基因或單DNA片段控制的顯性遺傳[20]，利用抗枯萎病材料進行雜交育種可以獲得抗枯萎病品種。本試驗對40份不同來源的西瓜種質資源的抗性鑒定結果可以看出，高感及感病的種質材料所占的比例較大，其總和占鑒定總數的62.5%，高抗種質資源缺乏，抗病資源僅占5.0%。因此，應加強全國范圍內西瓜枯萎病抗性種質資源的收集和鑒定工作，為多抗新品種的選育提供更加優良的材料。

本試驗完善了西瓜枯萎病苗期接種鑒定技術體系，但研究僅限于對接種方法、接種濃度、栽培土質、培養容器等方面的探討，外界環境(如接種生育期、菌齡、溫度等)的變化會導致西瓜幼苗生理上的生長緩慢和黃化，不可避免對表型鑒定結果有一定的影響。因此，開展影響西瓜枯萎病苗期鑒定相關因素的綜合評價與分析，并結合分子標記技術，建立西瓜枯萎病快速鑒定體系，以提高苗期鑒定的準確性具有十分重要的意義。