香菇原生質體雜交后代的遺傳分析

劉 娜， 張 敏， 宋 瑩， 劉俊杰

(遼寧省農業科學院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161

香菇(Lentinulaedodes)營養豐富，具有較高的保健價值，自古以來深受人們的喜愛[1]。中國是人工栽培香菇的發源地和世界香菇第一生產大國，目前，我國香菇年產量約為10萬t，占世界總產量的90%以上。香菇品質的好壞與品種有很大關系，所以優良香菇品種的選育尤為重要。

原生質體雜交育種技術中的單核原生質體是由雙核菌絲體中直接分離得來的，沒有經過有性階段，一般認為能更好地保持親本的性狀。利用這種原生質體再生單核體，更容易定向選育優良菌株[2]。同工酶分析作為分子遺傳標記技術之一，不僅被廣泛應用于動植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學分類的重要指標應用于真菌的分類鑒定中，特別是在屬內種間及品種之間的分類鑒定中是非常有效的[3-4]。

在食用菌雜交育種中，親本的合理選配及雜種的準確鑒定是至關重要的環節。多年來，育種工作者常常根據育種材料的生態型、生理特性及地理距離的差異選配親本。但是，這類差異與親本固有的遺傳差異往往并不完全一致。

本研究中的親本是基于酯酶同工酶技術、簡單重復序列區間(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)分子標記技術，結合農藝性狀選擇的4個菌株(168、931、荷香1號和野生香菇)，制備原生質體并單單雜交，采用酯酶同工酶技術對原生質體單核化對稱雜交獲得的后代及其親本進行遺傳分析，旨在鑒定雜交后代與親本的遺傳關系及雜交子的真實性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種及來源詳見表1。

表1 供試香菇菌株及其來源

PDA綜合培養基配方：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，3 g磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂，3 g蛋白胨，1 000 mL水，pH值自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交菌株獲得 獲得單核原生質體雜交菌株的試驗參照甘炳成等的方法[5]。

1.2.2 菌絲培養 將雜交親本及雜交后代菌株接于 25 mm×25 mm的試管內，每個菌株接10支，置于23 ℃恒溫培養15 d，刮取菌絲。

1.2.3 酯酶同工酶方法 采用垂直平板聚丙烯酰胺電泳法，收集供試菌株菌絲0.5 g/份，用液氮研磨，將樣品收集于 1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL樣品提取液。將研磨后的樣品在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，取其上清液。將上清液、蔗糖溶液按體積比1 ∶1混合后作為電泳樣品。點樣量為40 μL，以溴酚蘭作為電泳指示劑，在4 ℃條件下電泳，初期電壓為每板150 V，當溴酚蘭指示劑進入分離膠后電壓升為每板250 V，待指示劑遷移至距末端1 cm左右處停止電泳，染色，保存備用。

1.3 數據分析

聚類分析。相對遷移率(Rf)=X/Y。式中：X為從點樣孔下沿開始，酶帶在凝膠中的遷移距離；Y為從點樣孔下沿開始，指示劑在凝膠中的遷移距離。在測量遷移距離時，以酶帶的中部位置為準。依據酯酶酶譜，按照條帶的有無進行標記，在相同遷移率位置上，有條帶的記為1，無條帶的記為0。利用DPS數據處理軟件，分析得到供試菌株的聚類分析圖。

2 結果與分析

2.1 雜交親本與雜交后代酯酶同工酶圖譜

對酯酶同工酶圖譜經過軟件Gel-Pro analyzer進行條帶識別和人工審核的結果如下：由圖1-A、表2可知，親本59、xy2及其雜交后代共有遷移率各異的條帶13條。雜交后代ln3、ln4、ln8與親本有1條共同條帶，Rf為0.595，雜交后代有3條特異性條帶，Rf分別為0.351、0.402、0.571，說明雜交后代與親本之間有共源性，但雜交后代中又有屬于自己的特征酶帶，是有別于親本的新菌株。

表2 以59和xy2為親本的酯酶同工酶的相對遷移率

注：“—”表示沒有酶帶。下表同。

由圖1-B、表3可知，供試菌株親本ztd、59及其雜交后代的酯酶同工酶圖譜表現不同，酯酶同工酶酶譜帶數為5～10條，所有酶帶的Rf為0.171～0.804，6個菌株所共有的Rf為0.595、0.763，可以認為是香菇的基礎酶譜帶，表明6個香菇品種之間有同源性，在主要代謝過程中具有相似的生理性狀。4個雜交后代在Rf為0.253、0.282、0.361、0.386、0.430、0.481、0.557、0.598、0.620、0.804的位置與親本存在差異，表明雜交后代雖然與親本菌株間有相同的酶帶，但是又有各自的特征酶帶，為新菌株。其中雜交后代中ln15與其他雜交后代遺傳距離較遠，具有多條特征性條帶，說明ln15的變異幅度較大。

由圖1-C、表4可以看出，親本ztd、80與其雜交后代酶譜帶數和酶活性有較明顯的差異，其中共同的酶帶有2條，Rf分別為0.408、0.578。2個親本酶帶類型、數量、位置及寬度相差明顯，說明二者親緣關系較遠，為遠源雜交[6]；雜交后代酶帶類型、數量、位置及寬度相差較小，說明其親緣關系較近。Rf為0.170的是雜交后代共有而親本不具備的酶帶，可以看出，雜交后代有別于親本。

由圖1-D、表5可以看出，以ztd、xy2為親本，每個雜交后代與親本菌株有6～9條不等的酶帶。對供試菌株的遷移率分析表明，遷移率都在0.092～0.738之間。供試菌株在Rf為0.571、0.613這2處均有酶帶出現，為雜交親本與后代共有的酯酶酶帶。雜交后代擁有的3條酯酶酶帶中，Rf為0.399、0.417的酶帶與親本ztd共有，Rf為0.595的酶帶與親本xy2共有，而Rf為0.455的酶帶為雜交后代區別于親本所特有的酶帶。

表3 以59和ztd為親本的酯酶同工酶相對遷移率

2.2 聚類分析圖

從圖2可以看出，931(59)和野生香菇(xy2)2個菌株遺傳距離較遠。在相異系數為0.68時分為2類，第1類為ln3、ln4、ln8，第2類為59、xy2；雜交后代遺傳相異系數較小，在相異系數為0.51時聚為一類，但與2個親本的遺傳相異系數較大，在相異系數為0.85時聚為一類。由此可以看出，雜交后代是有別于2個親本的新菌株。

從圖3可以看出，以931(59)、168(ztd)為親本進行雜交，931(59)和168(ztd)的親緣關系較遠，在相異系數為0.78時分為3類：第1類為ln15，第2類為ztd、ln1、ln7、ln10，第3類為59；雜交后代中ln15與其他菌株的親緣關系較遠，其他幾個雜交后代親緣關系較近，在相異系數為0.73時雜交后代與親本ztd聚為一類，可以初步判斷，雜交后代遺傳性狀與ztd較為接近。在后期試驗中發現，ln1、ln7、ln10在生育期、菇體形態方面都接近親本ztd。

從以荷香1號(80)、168(ztd)為親本雜交后代的聚類分析結果可以看出，在遺傳相異系數為0.60時，第1類為親本80，第2類為雜交后代與ztd。雜交后代中ln18、ln22、ln25遺傳相異系數為0，ln11、ln12、ln14、ln17、ln27遺傳相異系數為0(圖4)。遺傳相異系數都為0的菌株說明它們具有共同的遺傳基因，為同一菌株。

表4 以80、ztd為親本的酯酶同工酶相對遷移率

表5 以ztd和xy2為親本的酯酶同工酶相對遷移率

由以168(ztd)和野生香菇(xy2)為親本的聚類分析結果看出，xy2與其他菌株親緣關系較遠，單獨為一類；雜交后代中幾個菌株遺傳距離較近，在遺傳相異系數為0.32時聚為一類；ln23、ln30的遺傳相異系數為0，為同一菌株；ln2、ln5、ln16的遺傳相異系數為0，為同一菌株(圖5)。

3 結論與討論

本研究采用酯酶同工酶技術，對雜交親本及其后代進行遺傳差異研究，酯酶同工酶遺傳分析結果表明，供試菌株酯酶同工酶酶譜帶數為4～10條，遷移率在0.092～0.804之間，所有雜交后代與親本之間既有共同酶帶，又有屬于自己的特征酶帶，可初步認為供試的24個雜交后代有別于親本。聚類分析結果表明，以931(59)、野生香菇(xy2)為親本的雜交群體，這2個親本菌株的遺傳距離較遠，在相異系數為0.68時分為2類，第1類為ln3、ln4、ln8，第2類為59和xy2；以931(59)、168(ztd)為親本進行雜交，在遺傳相異系數為0.78時分為3類，第1類為ln15，第2類為ztd、ln1、ln7、ln10，第3類為59，雜交后代中ln15與其他菌株親緣關系較遠；以荷香1號(80)、168(ztd)為親本，在遺傳相異系數為0.60時分為2類，第1類為親本80，第2類為雜交后代與ztd；以168(ztd)和野生香菇(xy2)為親本與雜交后代的聚類分析表明，野生菌株(xy2)與其他菌株親緣關系較遠，單獨為一類，雜交后代幾個菌株間遺傳距離較近。聚類分析結果也初步鑒定了雜交親本與后代之間的親緣關系，為以后的栽培試驗提供了理論依據。供試的24個雜交后代均為真實雜交后代，結果與前期雜交后代親本拮抗呈陽性試驗結果相符，說明酯酶同工酶技術可以作為鑒定雜交子真實性的標準之一。所有雜交后代中都具有特征酶帶，可作為判斷其他菌種是否為遼寧省農業科學院食用菌研究所選育菌株的依據之一。從聚類分析圖可以初步看出雜交后代的遺傳距離趨近于哪個親本，至于農藝性狀是否和聚類分析結果相符，還需要進行栽培性狀比較試驗。

中國香菇主栽品種遺傳背景相對狹窄，而野生資源存在豐富的遺傳多樣性，有意識地應用野生種作為雜交親本，是一種有效擴大栽培種遺傳多樣性的方法。為此，本研究將繼續利用野生資源進行香菇新菌株選育，以保證香菇產業的可持續健康發展。