紅棗根際解磷菌對土壤有機酸及速效磷含量的影響

劉勝亮， 朱舒亮， 楊 越， 李 靜， 李建貴

(1.新疆農業大學林業研究所，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學新疆紅棗工程技術研究中心，新疆烏魯木齊 830052

植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是能夠在植物根際土壤中定殖，并能夠促進植物生長、提高植物抗性或促進土壤養分循環的有益微生物[1-2]。有研究表明，植物根際促生菌可以促進土壤有機質分解、加速土壤養分循環、提高植物對土壤養分的利用效率，對農業生產意義重大[3-4]。何志剛等研究PGPR菌肥對馬鈴薯產量與肥料利用率影響時發現，增施促生菌肥能夠明顯提高馬鈴薯地下塊莖對鉀、氮、磷的吸收，能夠明顯促進馬鈴薯產量的提高[5]；燕紅等研究發現，微生物菌株可以明顯促進鉀、磷的溶解[6]；吳興興等研究發現，PGPR能夠促進蠶豆植株的生長，并能明顯提高蠶豆的莢果數[7]。

對解磷微生物的研究最早開始于20世紀30年代，前蘇聯科學家從土壤中分離得到1種溶磷能力較強的巨大芽孢桿菌[8]。20世紀50年代，科研人員從小麥根際土壤中分離得到溶解磷酸鈣能力較強的微生物[9]。目前，對解磷微生物進行研究發現，微生物在解磷時一般是通過分泌有機酸來實現的，有機酸可以通過螯合作用與Fe3+、Al3+、Ca2+等結合，從而達到溶解磷酸鹽的效果。王同等研究發現，紅壤溶磷菌B1主要通過分泌有機酸來溶磷[10]；石在強等研究解鹽促生菌Rs-5時發現，Rs-5菌株在溶磷過程中，檸檬酸、蘋果酸起主要作用[11]。本試驗通過對大田紅棗施入解磷能力較強的4種菌株P7、P13、P15、P18，對不同解磷菌進行動態觀測，研究解磷菌對紅棗根際土壤有機酸、速效磷含量的影響，為解磷菌在田間的開發應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在新疆農業大學林業研究所博湖南山實驗基地的紅棗園進行，該基地位于新疆巴音郭楞蒙古自治州博斯騰湖景區，86°40′～87°25′ E、41°56′～42°14′N，干燥少雨，溫差及蒸發量相對大，屬典型的大陸性荒漠氣候。

1.2 試驗材料

選擇樹齡相同、株形和產量相對一致的6年生灰棗作為試驗材料。供試解磷細菌P7(Bacillussp.)、P13(Acinetobactersp.)、P15(Acinetobactersp.)、P18(Enternhactersp.)由新疆農業大學林業研究所微生物實驗室提供，采用高溫滅菌處理的牛肉膏蛋白胨培養基進行培養，配方為：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0～7.2。

1.3 試驗處理

1.3.1 菌株擴繁 無菌環境中，將經過分離鑒定、解磷能力較強的菌株P7、P13、P15、P18進行復蘇活化，無抗平板上劃線，溫育24 h；超凈工作臺上挑選典型單菌落進行擴繁。

1.3.2 田間試驗 2016年4月25日，將4種單菌株進行甲哌利福霉素(利福平)標記，得到耐利福平的突變菌種；將突變菌株分別進行培養，結合使用基肥，將培養菌株施入到紅棗根際，同時在施用基肥的基礎上以分別施入菌劑培養基、清水為對照，共計6個處理(處理1：菌劑P7+基肥；處理2：菌劑P13+基肥；處理3：菌劑P15+基肥；處理4：菌劑P18+基肥；處理5：菌劑培養基+基肥；處理6：清水+基肥)，接種后1、15、30、45、60、90、120 d對其進行動態回收觀測。基肥施用量為10 kg/株，試驗組菌劑用量為原菌劑200 mL稀釋5倍，每株施用1 000 mL稀釋液；菌劑培養基對照用量為原菌劑培養基200 mL稀釋5倍，每株施用1 000 mL稀釋液；清水對照每株施用1 000 mL清水。采用穴施法施入，在棗樹正東方向距離紅棗樹10 cm位置挖1個長、寬、深分別為50、30、30 cm的施肥坑。每小區4株，重復3次，隨機排列，單灌單排。

1.3.3 土壤樣品的采集 分別在處理前(0 d)、接種處理后1、30、60、90、120 d，在原施肥坑采集土壤樣品200～300 g/株，將同一小區4株樹的土壤樣品充分混勻，按照四分法分2次取檢測土樣200～300 g。

1.4 測定內容與方法

1.4.1 土壤活菌數 無菌環境下取根際鮮土壤10 g，置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃恒溫振蕩30 min，使微生物細胞充分分散，即得到10-1稀釋液；取0.5 mL稀釋液與4.5 mL無菌水混勻，依次稀釋得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的稀釋液；將一系列稀釋液涂布在含有300 μg/mL利福平和300 μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨平板上，28 ℃培養2 d，進行計數。

1.4.2 土壤速效磷和有機酸含量 速效磷含量采用鉬藍比色法測定；土壤pH值采用酸度計法測定；有機酸含量采用高效液相色譜法測定[12-13]。

1.5 數據分析

采用SPSS 19.0、Excel 2003軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同解磷菌處理對土壤活菌數的影響

由表1可知，菌株P13、P15、P18施入的菌落數約在 108CFU/g，而菌株P7的菌落數相對較多，達到109CFU/g；接種后15 d，各菌株存活的菌落數有明顯下降，在4.44×107～5.98×107CFU/g之間，存活率為接種后1 d時的5%～10%；接種后30 d，各菌株的菌落數仍然有明顯下降，在1.18×107～2.31×107CFU/g之間，菌株P7的活菌數相對較多，達到2.31×107CFU/g；接種后45～120 d，各菌株菌落數變化不大，基本穩定在107CFU/g左右。由此可見，4種解磷菌株在接種后30 d時開始適應土壤環境，并形成定殖能力。

表1 菌株接種后不同時期紅棗根際土壤的菌落數

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表2至表4同。

2.2 不同解磷菌處理對土壤pH值的影響

由圖1可知，與施菌前相比，接種后1 d各處理的pH值都有明顯下降，可能是由于施加菌液和水的原因導致；接種后30 d時pH值與接種后1 d相比有明顯上升，但仍低于未接種的時候；接種后30～120 d，各處理土壤的pH值呈逐漸降低趨勢，施加菌株的4個處理其pH值明顯低于對照僅接種菌劑培養基或清水。

2.3 不同解磷菌處理對土壤速效磷含量的影響

由圖2可知，接種后1 d，接種菌株及菌劑培養基的紅棗根際土壤速效磷含量較接種前有明顯上升；與接種后1 d相比，接種后30 d接種菌株P13、菌劑培養基的紅棗根際土壤速效磷含量有所下降，其他處理均有所上升，其中接種菌株P15的土壤速效磷含量增加幅度相對最大，達59.76%；接種后 60 d，各處理土壤的速效磷含量均超過30 mg/kg，但與接種后30 d相比多呈下降趨勢；接種后90 d，接種菌株P13、P15、P18的土壤速效磷含量較接種后60 d有明顯增長；接種后120 d，接種菌株P13、P15、P18的土壤速效磷含量有較明顯的增加，其中以接種菌株P15優勢最為明顯，而接種菌株P7及對照的土壤速效磷含量增長幅度相對較小；與對照僅接種菌劑培養基或清水相比，接種菌株P7的土壤速效磷含量增加沒有表現出明顯的優勢，接種菌株P13的土壤速效磷含量在接種90 d后增加優勢明顯，接種菌株P15的土壤速效磷含量在接種 30 d 后增加優勢明顯，而接種菌株P18的處理，其土壤速效磷含量從一接種開始整體呈增加趨勢，接種后120 d時增幅相對最大。因此，接種菌株P15、P18的處理解磷效果相對最好，可提高土壤速效磷的含量。

2.4 不同解磷菌處理對土壤有機酸含量的影響

2.4.1 丙酮酸 由表2可見，接種前及接種后1 d各處理土壤均未檢測到丙酮酸；接種后30 d，各處理土壤均檢測到丙酮酸，且這一時期丙酮酸含量相對較高，其中，接種菌株P13、P18的紅棗根際土壤丙酮酸含量超過1.9 mg/kg；接種后 60 d，除接種菌株P15的根際土壤丙酮酸含量有小幅上升外，其他處理的丙酮酸出現不同程度的下降，其中接種菌株P7的土壤丙酮酸含量下降最為明顯，而僅接種菌劑培養基、清水的對照處理未檢測到丙酮酸；接種后90 d，接種菌株P13、P15、P18的根際土壤丙酮酸含量有明顯下降，而其他處理較接種后60 d有所上升；接種后120 d，接種菌株P13、P15和清水的根際土壤丙酮酸含量較接種后90 d略有增加，其他處理則有小幅下降；整體來看，與對照相比，施加解磷菌的土壤其丙酮酸含量有明顯提高。

表2 不同解磷菌處理對紅棗根際土壤丙酮酸含量的影響

2.4.2 乳酸 由表3可見，接種后1 d與接種前相比，除接種清水的紅棗根際土壤乳酸含量未發生變化外，其他處理乳酸含量均有明顯增加；接種后30 d，各處理根際土壤乳酸含量均有不同程度增加，其中接種解磷菌的土壤乳酸含量增加較為明顯，接種菌株P13的土壤乳酸含量相對最高，達12.398 mg/kg；接種后60 d，紅棗根際乳酸含量出現明顯下降，接種菌株P15、P18及菌劑培養基、清水的土壤未檢測到乳酸存在；接種后90 d，除接種清水的土壤未檢測到乳酸外，其他各處理均檢測到乳酸存在，其中接種菌株P7、菌劑培養基的土壤乳酸含量相對較高，在5 mg/kg以上；接種后120 d，菌株P7、P18及菌劑培養基的土壤乳酸含量有所下降外，其他處理乳酸含量有不同程度的增加，其中接種菌株P13的土壤乳酸含量增加較為明顯；整體來看，與接種清水相比，接種菌株可明顯提高土壤的乳酸含量。

表3 不同解磷菌處理對紅棗根際土壤乳酸含量的影響

2.4.3 乙酸 由表4可見，接種前各處理土壤均未檢測到乙酸存在；接種后1 d，除接種菌株P7、P15的土壤檢測到少量乙酸外，其他處理土壤均未檢測到乙酸存在；接種后30 d，各處理土壤的乙酸含量有明顯增加，其中接種菌株P15的土壤乙酸含量增加最為明顯，達到1.552 mg/kg；接種后60 d，對照處理的土壤乙酸含量較接種后30 d有所下降，而接種解磷菌株的4個處理其土壤乙酸含量保持相對穩定或有明顯增加；接種后90 d，接種菌株P7的紅棗根際土壤乙酸含量有明顯增加，乙酸含量相對最高，為11.025 mg/kg，而接種菌株P15、P18及清水的土壤未檢測到乙酸存在；接種后120 d，接種菌株P7的土壤乙酸含量相對較高，為0.966 mg/kg，對照處理的土壤乙酸含量明顯低于接種解磷菌株的。

2.5 速效磷含量與土壤有機酸含量的相關性分析

統計分析結果表明，紅棗根際土壤丙酮酸、乳酸、乙酸3種有機酸含量與土壤速效磷含量的相關系數分別為0.338、0.318、0.061，均呈正相關，其中，丙酮酸含量與土壤速效磷含量呈顯著性相關(P<0.05)。

表4 不同解磷菌處理對紅棗根際土壤乙酸含量的影響

3 結論與討論

土壤低分子量有機酸的產生與土壤微生物數量和活性密切相關[14]，土壤微生物的生理活動能夠合成有機酸，其次生代謝產物影響著植物根系的有機酸含量[15]。本試驗在紅棗根際土壤施加4種解磷菌，在紅棗根際土壤中形成良好的定殖能力，對紅棗根際土壤有機酸的產生有一定影響，與接種菌劑培養基、清水相比，接種菌株的紅棗根際土壤速效磷和丙酮酸、乙酸、乳酸等有機酸含量有不同程度增加，這與王同等的研究結論[10]相吻合。試驗結果表明，接種菌株P15、P18的溶磷效果相對較好，接種菌株P7有利于提高土壤乙酸含量，接種菌株P13有利于土壤丙酮酸和乳酸的提升，這說明微生物溶磷過程中有機酸是一種重要因子，但不是唯一因素[16]，這可能與不同種類有機酸所含功能基數目及螯合能力不同有關，從而具有不同的活化能力[17]。

另外，統計分析結果表明，紅棗根際土壤丙酮酸、乳酸、乙酸3種有機酸含量與土壤速效磷含量均呈正相關，說明這3種有機酸可促進土壤速效磷含量的提升，但相關系數相對較小，究竟是何因子起關鍵作用還需要作進一步的研究探討。