真空包裝冷鮮雞中腐敗菌微生物的分離鑒定

賴宏剛， 蔣云升， 張元嵩， 曹 宏， 肖 歡

(1.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇揚州 225127； 2.江蘇里下河地區農業科學研究所，江蘇揚州 225007

冷鮮雞是指經檢疫檢驗后屠宰得到的雞胴體，經迅速冷卻使其溫度在1 h內降到0～4 ℃，并保持在0～4 ℃下加工、流通和零售的鮮雞肉[1]。冷鮮雞在生產、加工和儲運過程中，不可避免地會被空氣、容器、包裝材料、原料本身等所攜帶的細菌污染，又因為其營養成分豐富和含水量高[2]，一旦條件適宜，其攜帶的微生物就會迅速生長繁殖，出現變色、變味以及表面發黏、產生臭味等不良變化[3]，從而使其貨架期縮短，這也成為限制冷鮮雞產業發展的瓶頸。因此，建立系列的綜合保鮮技術研究就成為解決冷鮮雞及醬雞制品發展的關鍵問題，而腐敗菌的分離鑒定是這個問題得以解決的基礎。

本研究采用平板劃線分離方法分離純化冷鮮雞中的優勢微生物菌群，再通過傳統的生理生化試驗及16S rDNA測序的方法，對冷鮮雞中的主要腐敗菌進行菌種鑒定，從而為靶向控制冷鮮雞加工過程中的微生物生長提供依據，達到延長貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

活雞，購于當地金鑫花園菜市場，經獸醫檢驗檢疫合格[4]。聚乙烯(polyethylene，簡稱PE)食品包裝袋，購自江陰市永達復合包裝有限公司。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、無水氯化鈉、無水硫酸鉀、甘油、磷酸鹽緩沖液、二苯胺、醋酸、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫-80、硫酸鎂、硫酸錳、CaCO3、膽鹽、H2SO4、H2O2、石蠟、中性紅、結晶紫、MgSO4、KHPO4、D-甘露醇、檸檬酸及其他化學試劑均為分析純級別；1%酚紅溶液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、奈氏試劑、格里斯氏試劑、吲哚試劑，為筆者自行配制；微量生化反應管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 培養基及培養條件

1.3.1 培養基的配制 (1)平板計數瓊脂(plate count agar，簡稱PCA)培養基，用于細菌的培養。主要配方如下：5.0 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸膏，1.0 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至7.2±0.02，于121 ℃滅菌15 min。(2)假單胞菌計數瓊脂培養基(Pseudomonades培養基)，用于假單胞菌的分離培養。主要配方如下：20 g蛋白胨，5 g無水氯化鈉，1 g無水硫酸鉀，13.6 g瓊脂，10 mL甘油，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至7.2，于 121 ℃ 滅菌15 min。(3)乳酸菌計數瓊脂培養基(MRS)，用于乳酸桿菌的分離培養。主要配方如下：2 g檸檬酸銨，5 g乙酸鈉，20 g葡萄糖，1 mL吐溫-80，0.58 g硫酸鎂，0.25 g硫酸錳，15 g瓊脂，20 g CaCO3，1 000 mL 蒸餾水，將pH值調至6.2～6.4，于121 ℃滅菌 15 min。(4)結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)培養基，用于腸桿菌的分離培養。主要配方如下：3 g酵母浸膏，7 g 蛋白胨，1.5 g膽鹽，5 g氯化鈉，10 g乳糖，0.03 g中性紅，0.002 g結晶紫，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至 7.3～7.5，于121 ℃滅菌15 min。(5)熱殺索絲菌計數瓊脂培養基(STAA)，用于熱殺索絲菌的分離培養。主要配方如下：20 g 蛋白胨，15 g甘油，1 g MgSO4，2 g酵母提取物，1 g KHPO4，13 g瓊脂，溶于 1 000 mL 蒸餾水。滅菌后，加入下列滅菌的水溶液：50 μg/mL 鏈霉素硫酸鹽，50 μg/mL環己六亞胺，50 μg/mL乙酸鹽。

1.3.2 培養條件 本研究中腐敗菌微生物的培養條件見表1。

1.3.3 主要儀器與設備 3730XL型測序儀，Applied Biosystem；FR980型凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-5型穩壓電泳儀，北京六一儀器廠；2720thermal cycler型PCR儀，Applied Biosystems；HC-2518R冷凍高速離心機，上海伊沐醫療器械有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；BCD-203型冰箱，海信(北京)電器有限公司；BL3-120型超聲波清洗機，上海比朗儀器有限公司；DT-200 型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；HH-8型數顯恒溫水浴鍋，臨安同華電器有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司；pHS-3C型精度pH計，上海精密科學儀器有限公司；QYC-200型全溫培養搖床，上海福瑪實驗設備有限公司；XSP-13A型生物顯微鏡，江南光學儀器廠；YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHG-9148A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海三申醫療器械有限公司。

表1 本研究中腐敗菌分離、計數用培養基與培養條件

1.4 方法

1.4.1 樣品的制備 冷鮮雞制備步驟如下：活雞宰殺→剃毛凈膛→修整清洗→采用濃度為50 mg/L的次氯酸鈉溶液[5]浸泡、淋洗→用冷卻水沖洗、瀝干→真空包裝→4 ℃保藏。

1.4.2 微生物菌相構成分析 冷鮮雞樣品于4 ℃儲存至第10天，樣品腐敗變質。于無菌條件下稱取25 g樣品，剪碎后置于裝有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質30 min，取上清，依次作1 ∶10遞增稀釋，每個稀釋度作3個平行，倒入冷至45 ℃的選擇性培養基，放入恒溫培養箱內倒置培養48 h后計數[6]。

1.4.3 腐敗菌菌種的分離純化 從選擇性培養基上挑取典型菌落，在其相應平板上作劃線分離，分離純化2～3次，將代表性菌株移殖至斜面，保藏備檢[7]。

1.4.4 菌落形態的觀察 在顯微鏡下觀察已分離純化的單個菌落的大小、顏色、形狀、隆起度、邊緣結構、表面光滑或粗糙度、光澤度、透明度和質地等[8]。通過革蘭氏染色、鞭毛染色及芽孢染色，對重新培養 18～24 h且長勢好的單菌落進行顯微鏡觀察。菌體形態包括細胞形態(短桿、長桿及球狀等)；革蘭氏染色分陰性和陽性[9]。

1.4.5 生理生化試驗 根據《食品微生物鑒定圖譜》及《常見細菌系統鑒定手冊》[10]，進行氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發酵、精氨酸雙水解酶活性以及V-P(Voges-Proskauer)試驗，根據菌落形態、菌體形態和生理生化試驗結果，最終將細菌初步鑒定到科和屬。

1.4.6 腐敗菌的PCR檢測

1.4.6.1 基因組DNA的提取 采用細菌DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。

1.4.6.2 菌種鑒定基因序列擴增 以基因組DNA為模板，進行細菌16S rDNA片段的PCR擴增，采用通用引物擴增16S rDNA，其中7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

PCR反應體系(25 μL)：0.5 μL模板(20～50 ng/μL基因組DNA)，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.2 μL酶，0.5 μL引物F(10 μmol/L)，0.5 μL引物R(10 μmol/L)，加雙蒸水至25 μL。

PCR循環條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4.6.3 序列片段分析及發育樹的構建 將序列提交至GenBank數據庫，在GenBank中使用BLAST程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的DNA序列。運用MEGA 6軟件進行系統發育樹構建。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞中微生物菌相的構成

將冷鮮雞樣品于4 ℃保藏培養第10天，檢測其菌落總數達到1.2×105CFU/g，其腐敗菌相構成如圖1所示，可見冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(占比51.0%)和乳酸菌(占比31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(占比13.3%)、腸桿菌(占比4.3%)。

2.2 菌落形態特征

將純化得到的菌種分別命名為J1、C1、R1、S1，鑒定得到的菌落特征及菌體形態見表2。

表2 菌落特征及菌體形態

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。表3同。

2.3 腐敗菌顯微鏡圖

通過革蘭氏染色試驗初步分析這4種分離得到的細菌。根據菌體的形態大小、染色結果初步確定J1、S1為革蘭氏陰性細菌，C1、R1為革蘭氏陽性細菌。此外可以看出，這4株菌并無芽孢(圖2)。

2.4 生理生化鑒定

根據《食品微生物鑒定圖譜》及《常見細菌系統鑒定手冊》[10]，通過鏡檢各種菌在顯微鏡下的菌體形態、革蘭氏染色情況等，結合表3的生理生化試驗結果，初步判定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌科，R1為乳酸菌屬，S1為環絲菌屬。

表3 生理生化指標測試結果

注：“NT”表示未檢測。

2.5 16S rDNA基因PCR擴增結果

將分離出的腐敗菌典型菌株的單菌落培養后提取DNA，進行16S rDNA PCR擴增。由圖3可以看出，4株菌得出的條帶大小不同，J1、R1、C1、S1條帶大小分別為1 482、1 351、1 528、1 365 bp。

2.6 系統發育樹的構建

將測序所得16S rDNA序列與核酸序列數據庫中已知序列進行比對，選取相似性高的菌株序列構建系統發育樹，結果如圖4和表3所示。通過同源性比較可得：J1與假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)同源性最高；C1與腸桿菌屬的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)同源性最高；R1與乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高；S1與環絲菌屬的熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)同源性最高。

表3 各菌株測序的種屬關系

熒光假單胞菌隸屬于假單胞菌屬。假單胞菌是導致食品腐敗變質的主要微生物，也是冷鮮雞中存在的優勢菌[11]。這是因為假單胞菌在低溫條件下也能利用葡萄糖迅速生長繁殖，使肉制品腐敗變質，從而影響其貨架期。冷鮮雞生產加工和保藏期間的溫度為4 ℃，有利于假單胞菌的生長繁殖。

植物乳桿菌隸屬于乳桿菌屬，在有氧時生長差，通常是無氧包裝肉類食品的優勢腐敗菌，廣泛存在于動物、蔬菜和食品中[12]。

陰溝腸桿菌隸屬于腸桿菌屬。腸桿菌屬普遍源于人和動物的腸道排泄物，這可能與冷鮮雞在生產、加工和儲運過程中遭到活雞腸道內容物的污染有關[13]。

熱殺索絲菌隸屬于環絲菌屬，在0～30 ℃下均能生長，主要存在于肉制品中。它也是肉類食品中重要的腐敗菌，因此是引起真空包裝冷鮮雞腐敗的主要微生物[14]。

3 討論

趙文紅等從腐敗冰鮮鴨中鑒定出假單胞菌屬、氣單胞菌屬、乳酸菌屬、腸桿菌屬、節桿菌屬、紫色桿菌屬等[8]。周濤等對鹽水鵝的主要腐敗菌進行測序和序列比對，得到最終的鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)[15]。梁慧等通過傳統生理生化試驗鑒定冷鮮雞中腐敗微生物的結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌及假單胞菌，16S rDNA檢測結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物含有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌、節桿菌、克氏庫克菌及假單胞菌等，兩者相對比有較多相同的微生物[16]。高磊等從變質冷鮮雞的腿肉中分離并通過感官評價篩得到5株優勢腐敗菌，經菌落特征、菌體形態、生理生化試驗以及16S rDNA序列分析，結果顯示為類產堿假單胞菌、熱殺索絲菌、腐生葡萄球菌、無色桿菌、液化沙雷氏菌[9]。本研究對貯藏在4 ℃的冷鮮雞進行菌相分析可知，冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(51.0%)和乳酸菌(31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(13.3%)、腸桿菌(4.3%)。本研究對分離出的主要腐敗菌進行分離、純化，然后進行菌落特征、菌體形態觀察及生理生化鑒定，初步確定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌屬，R1為乳酸菌屬，S1為索絲菌屬。然后提取細菌的16S rDNA，進行PCR擴增后，經測序和序列比對，得到最終的鑒定結果：J1為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，C1為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，R1為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，S1為熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)。