高效纖維素降解菌株篩選及其復(fù)合微生物菌劑在有機(jī)堆肥中的應(yīng)用效果

岳 丹， 王 磊， 喬莉娟， 李丹花， 昝立峰

(1.邯鄲學(xué)院實(shí)驗(yàn)與實(shí)訓(xùn)中心，河北邯鄲 056005； 2.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲 056005

隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步以及人口的增長，農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，規(guī)模不斷壯大，我國國民生活水平得到有效改善。但是在糧食種植和畜禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生了大量作物秸稈、玉米芯、畜禽糞便等各類有機(jī)廢棄物，對(duì)我國空氣、水、土壤等都造成了嚴(yán)重的污染和危害[1]。鑒于自然排放的畜禽糞便等廢棄物對(duì)環(huán)境的污染和危害，目前國際上對(duì)其主要以無害化、資源化的原則進(jìn)行處理。目前采用的方法有生產(chǎn)沼氣能源，制作發(fā)酵飼料和高溫堆肥技術(shù)等。其中高溫堆肥技術(shù)以其無害化程度高、腐熟程度好、處理規(guī)模大、成本較低等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為畜禽糞便處理的首選[2]。

堆肥是一個(gè)有機(jī)物生物分解的過程，分為4個(gè)階段，即中溫、高溫、降溫、成熟熟化階段[3]。在此過程中，微生物群落結(jié)構(gòu)不斷變化，易氧化的有機(jī)質(zhì)變成更加穩(wěn)定的有機(jī)質(zhì)，最終形成堆肥產(chǎn)物。堆肥產(chǎn)物已經(jīng)被廣泛用作土壤調(diào)節(jié)劑和土壤肥料[4]，在改善土壤肥力和抵抗病菌方面具有巨大潛能。研究表明，在微生物參與的堆肥生產(chǎn)過程中，最初的碳氮比在(25～30) ∶1之間被認(rèn)為是堆肥生產(chǎn)的最佳條件[5]，所以畜禽糞便堆肥中常常加入作物秸稈來調(diào)節(jié)物料最初的碳氮比[6]，這也有利于農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的資源化利用。雖然很多研究表明接種外源微生物菌劑可以促進(jìn)堆肥進(jìn)程，加快堆肥的腐熟[7-9]，但是堆肥混合物料中的纖維素降解緩慢，一直是影響堆肥產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要因素。通過在堆肥過程中添加高效纖維素降解菌可以有效促進(jìn)纖維素的降解，加快堆肥腐熟和穩(wěn)定。因而，篩選和鑒定具有高效纖維素降解能力的菌株、制備微生物菌劑，是提高高纖維堆肥穩(wěn)定性的重要手段[10-12]。

本研究從竹林表層土壤篩選高效纖維素降解菌，將多種菌株混合制備成復(fù)合微生物菌劑并添加到堆肥原料中進(jìn)行高溫發(fā)酵，研究菌劑的堆肥效果，為構(gòu)建高效降解纖維素的復(fù)合微生物菌劑提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種分離材料來自河北省邯鄲市竹林表層土壤。采集樣品時(shí)取1 g土壤放入無菌錐形瓶中，加入玻璃珠振蕩培養(yǎng)1 h備用。

1.2 菌株的篩選

將土壤樣品制成不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，分別接種至羧甲基纖維素鈉平板中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，將所得菌株多次劃線分離，得到的菌株純培養(yǎng)。將所分離菌株點(diǎn)接于纖維素剛果紅培養(yǎng)基中，量取并計(jì)算菌株透明圈直徑(D)和菌圈直徑(d)的比值，即為HC比值。

1.3 菌株的鑒定

分別提取細(xì)菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，以27F和1 492R為16S rDNA的引物進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增[13]。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Solarbio公司)回收目的條帶，連接到pGM-T載體(Solarbio公司)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將陽性重組子送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將得到的序列通過BLAST軟件與GeneBank中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行聚類分析構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 微生物菌劑的制備

將分離純化的纖維素降解菌株分別置于25 ℃、150 r/min 的搖床中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，待菌量達(dá)到 108個(gè)/mL 時(shí)，取菌株的菌懸液分別按照體積比等比例混合，制成微生物菌劑備用。

1.5 堆肥試驗(yàn)

將豬糞和秸稈混合后調(diào)節(jié)碳氮比至(25～30) ∶1之間，水分控制在60%左右。試驗(yàn)共分為菌劑組、對(duì)照組這2組，每組3次重復(fù)，每組物料初始質(zhì)量均為20 kg。

菌劑組為每千克物料噴施5 mL自制菌劑并混合均勻[14]。對(duì)照組只添加相同體積的無菌水。菌劑和物料充分混勻后分別放置于泡沫箱中，每3 d翻堆1次。

1.6 指標(biāo)測定

試驗(yàn)期間每天09：00和16：00分別在距堆體表面10 cm處測量溫度，取溫度平均值作為堆體溫度。總有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀容量-外加熱法測定，總氮含量采用凱氏定氮法測定[15]。碳氮比(C/N)為總有機(jī)碳含量和總氮含量的比值。纖維素降解率的測定參照劉旭的測定方法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

通過羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法的初步篩選和純化，共得到5株菌株。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并測定菌株圈直徑與菌落直徑的比值(HC)，由表1可知，5株菌株具有細(xì)菌的典型形態(tài)特征，且均具有明顯的透明圈，具備降解纖維素的能力。

表1 菌株的形態(tài)特征

菌株L1、L2、L3、L4、L5的16S rDNA測序長度分別為997、968、672、1026、940 bp。將序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)的Blast軟件中進(jìn)行同源性比對(duì)，在GeneBank中下載同源性高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖1可知，菌株L1、L2為小麥蒼白桿菌(Ochrobactrumtritici)，L3為中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)，L4為綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)，L5為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。堆肥是微生物參與的高溫發(fā)酵過程。相對(duì)真菌而言，細(xì)菌具有更快的生長速率和更高的溫度耐受力，在堆肥的穩(wěn)定和腐熟中發(fā)揮重要作用[17]。因此，采用篩選出的具有高效纖維素降解能力的細(xì)菌制備微生物菌劑，可以增加堆肥中微生物的數(shù)量、堆肥中有機(jī)質(zhì)和纖維素的降解效率，增強(qiáng)堆肥穩(wěn)定性。

2.2 3堆肥的溫度變化

將制備的微生物復(fù)合菌劑添加到堆肥中進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，每天定時(shí)測定堆體溫度，得到堆肥生產(chǎn)過程中的溫度變化情況。由圖2可知，接種復(fù)合微生物菌劑的菌劑組堆體的最高溫度為62.2 ℃，高于對(duì)照組堆體(最高溫度為58 ℃)；菌劑組、對(duì)照組堆體溫度維持在50 ℃以上的時(shí)間分別為10、7 d，堆體升溫到最高溫度所用時(shí)間分別為6、9 d，溫度降至40 ℃以下所用時(shí)間分別為21、27 d。在堆肥生產(chǎn)過程中，微生物將有機(jī)物質(zhì)發(fā)酵，降解至堆肥腐熟。溫度是該過程中影響微生物新陳代謝最主要的因素，也是影響堆肥效果和堆肥產(chǎn)品質(zhì)量的重要參數(shù)[5]。研究表明，堆肥原料堆體溫度處于50 ℃以上的時(shí)間必須保持在5～7 d，以確保病原體的有效滅活[18]。這說明菌劑組和對(duì)照組堆肥均達(dá)到了腐熟無害化的標(biāo)準(zhǔn)，但是接種復(fù)合微生物菌劑可以提高堆肥溫度，縮短堆肥周期，保證堆肥質(zhì)量。

2.3 堆肥碳氮比值的變化

在堆肥過程中，隨著有機(jī)物的降解，碳氮比(C/N)不斷發(fā)生變化[19]。由于C/N與堆肥過程中的許多化學(xué)特性有關(guān)，所以C/N是描述不同堆肥穩(wěn)定性最合適的參數(shù)[20-21]。由圖3可知，隨著堆肥的發(fā)酵，C/N逐漸降低。菌劑組C/N從最初的30下降到15.4，對(duì)照組從最初的30.6下降到18。有研究表明，當(dāng)堆肥的C/N低于20時(shí)，有機(jī)物達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，堆肥腐熟[22]。由此可見，菌劑組和對(duì)照組堆肥均達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)，且菌劑組比對(duì)照組先達(dá)到腐熟。在堆肥過程中，菌劑組堆肥C/N呈先升高再降低的趨勢，整體呈下降趨勢，這可能是由于高溫增加了氨的排放量，導(dǎo)致較高的氮素?fù)p失，從而使難分解的有機(jī)物質(zhì)的降解速率減緩，使得一定時(shí)期C/N相對(duì)較高[8，23]。

2.4 堆肥的纖維素含量變化

堆肥的纖維素含量變化是反映堆肥處理效果的直接指標(biāo)，結(jié)果如圖4所示。30 d時(shí)，菌劑組堆肥纖維素降解率為24.7%，對(duì)照組堆肥纖維素降解率為17.3%，這說明接種復(fù)合菌劑能夠降低堆肥中的纖維素含量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中篩選得到5株高效纖維素降解菌株，將菌株L1、L2、L3、L4、L5的16S rDNA序列在NCBI的Blast軟件中進(jìn)行同源性比對(duì)，確定L1和L2為小麥蒼白桿菌，L-3為中華根瘤菌屬，L-4為綠針假單胞菌，L5為枯草芽孢桿菌。

將制備的微生物復(fù)合菌劑添加到堆肥中進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，結(jié)果表明，接種復(fù)合微生物菌劑的菌劑組、對(duì)照組堆體最高溫度分別為62.2、58 ℃，50 ℃以上的時(shí)間分別為10、7 d，C/N分別從30、30.6下降到15.4、18；菌劑組和對(duì)照組堆肥均達(dá)到了腐熟無害化標(biāo)準(zhǔn)，但是接種復(fù)合微生物菌劑可以提高堆肥溫度，縮短堆肥周期，保證堆肥質(zhì)量。

在堆肥試驗(yàn)中，為了適應(yīng)微生物的生長需要，加入了作物秸稈作為調(diào)理劑調(diào)節(jié)堆肥物料最初的C/N[6]。作物秸稈中的纖維素是堆肥中的難降解物質(zhì)，堆肥試驗(yàn)結(jié)果表明，30 d時(shí)菌劑組、對(duì)照組堆肥纖維素含量分別降至24.7%、17.3%，復(fù)合微生物菌劑可以高效降解堆肥中的纖維素，促進(jìn)堆肥進(jìn)程。