白花丹醌對肝癌細胞SMMC-7721凋亡和自噬的影響

林宇寧，王聲善，呂貝貝，馬 靜，陳永欣，鐘 靜，劉雪梅，韋燕飛

(廣西中醫藥大學基礎醫學院生理學教研室，廣西 南寧 530200)

白花丹醌(5-羥基-2-甲基-1,4-萘醌)是一種活性萘醌成分，存在于植物白花丹中，具有抗炎、神經保護、抗癌、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗細菌、抗真菌等多種藥理學活性[1]。白花丹醌的抗腫瘤活性受到廣泛關注，目前大量研究表明，在多種不同腫瘤細胞和腫瘤動物模型中，白花丹醌具有抗增殖、抑制侵襲與轉移、促凋亡、化療放療增敏活性。在肺癌研究中發現，白花丹醌通過下調MMP-2與u-PA基因的表達，抑制A549人肺癌細胞的侵襲和轉移[2]。在前列腺癌中，白花丹醌通過濃度和時間依賴性方式抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，從而誘導PC-3和DU145細胞的凋亡和自噬[3]。此外，白花丹醌可升高Bax水平，并下調Bcl-2水平，從而抑制肝癌細胞Hep2的侵襲并誘導其凋亡[4]。本實驗以人肝癌細胞株SMMC-7721為研究對象，觀察白花丹醌對SMMC-7721細胞凋亡、自噬的影響及其相關作用機制。

1 材料

1.1細胞株人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院上海細胞生物所。

1.2藥物與試劑白花丹醌(plumbagin)購自Sigma公司；高糖DMEM培養基為Hyclone公司產品；新生牛血清為四季青公司產品；TRIzol(Aidlab公司，批號:252250AX)；RNase酶(TransGen公司，批號：I21222)；兔抗LC3B、兔抗Beclin1單克隆抗體，購自Cell Signaling公司；凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(貨號：S7023)、自噬抑制劑3-MA(貨號：S2767) ，均購自Selleck公司。

1.3儀器細胞培養箱(日本Sanyo公司)；Sorvall ST 16R高速離心機(美國Thermo Fisher公司)；7900/Viia7實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；BX53光學顯微鏡(日本Olympus公司)；muLISKANMK3酶標儀(美國Thermo公司)； HT7700型電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

2 方法

2.1細胞培養及分組處理SMMC-7721細胞培養于含15%胎牛血清的DMEM培養液，放置在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每天觀察細胞生長情況，每2 d更換1次細胞培養液，長滿培養瓶后消化傳代，待傳至3代后，80%貼壁的細胞用于實驗。作為對照的溶劑組為含1‰ DMSO和2% FBS的DMEM培養基。

2.2MTT法檢測細胞增殖抑制率3×108·L-1生長狀態良好的細胞接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，37℃培養過夜，以不含FBS的DMEM同步化并干預細胞，每組設5個復孔，分別加入濃度為0、0.5、3、6、10 μmol·L-1的白花丹醌，另設空白對照組，不接種細胞，只加入含有 2% FBS的DMEM培養基。培養6、12、24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，在培養箱中繼續孵育4 h，加入DMSO 150 μL，酶聯免疫檢測儀測定568 nm波長處的吸光度值(OD值)。按公式計算抑制率：抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

2.3透射電鏡觀察細胞凋亡與自噬形態取2×106個SMMC-7721細胞種植于規格為35 mm的培養皿中，白花丹醌(3 μmol·L-1)作用24 h后，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，4℃下，先用1%的鋨酸緩沖試劑和2.5%的戊二醛溶液將細胞固定2～4 h后，用丙酮和乙醇將細胞脫水，再將其用環氧樹脂包裹起來，定位染色后封片，透射電鏡觀察并照相。

2.4免疫熒光檢測SMMC-7721細胞自噬標記蛋白LC3的表達將已爬好細胞的玻片放置在培養板上，PBS溶液浸潤，4%多聚甲醛溶液固定15 min。沖洗爬片3次后，用吸水紙吸取玻片上殘留的PBS溶液，將無外來感染物的山羊血清滴在爬片上，30 min后，滴入稀釋的一抗，4℃孵育過夜；次日，PBST溶液沖洗玻片，吸去殘留的PBST溶液后，將稀釋的熒光二抗添加到玻片，(20～37) ℃濕盒內孵育1 h后，PBST溶液清洗玻片3次。在玻片上滴入DAPI溶液，避光孵育5 min，染核，PBST洗去殘留的DAPI溶液；使用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察分析標本。

2.5qPCR法檢測SMMC-7721細胞Beclin1、Atg7、Atg5mRNA的表達TRIzol法提取SMMC-7721細胞總RNA，通過Nano-100微量分光光度計檢測總RNA含量。取RNA 4.284 μg，采用RNase H逆轉錄酶將其逆轉錄成cDNA。根據Gene Bank查找基因序列并自行設計引物，Beclin1、Atg7、Atg5引物序列見Tab 1。以β-actin作為內參，通過2-△△CT方法，計算mRNA相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of Beclin1,Atg7 and Atg5

2.6免疫印跡法檢測SMMC-7721細胞LC3、Beclin1、Atg7、Atg5蛋白表達將細胞分為兩組，分組一為：對照組、Z-VAD-FMK組(20 μmol·L-1)、白花丹醌組(3 μmol·L-1)、白花丹醌(3 μmol·L-1)+Z-VAD-FMK(20 μmol·L-1)組。分組二為：對照組、3-MA組(20 μmol·L-1)、白花丹醌組(3 μmol·L-1)、白花丹醌(3 μmol·L-1)+3-MA(20 μmol·L-1)組。兩組細胞分別預孵育凋亡抑制劑 Z-VAD-FEK或自噬抑制劑 3-MA 1 h后，加入白花丹醌干預24 h。每孔細胞加含PMSF的裂解液，裂解完成后，移至離心管中離心5 min，取上清液，測定蛋白濃度。6% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，電轉至PVDF膜，含5%脫脂奶粉封閉液TBST室溫封閉2 h。加入一抗4℃孵育過夜，HRP標記二抗37℃搖床孵育2 h。ECL化學發光法，X線底片曝光顯影，以β-actin為內參，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結果

3.1白花丹醌對SMMC-7721細胞增殖的影響MTT結果顯示(Tab 2)，0.5～10 μmol·L-1的白花丹醌能抑制SMMC-7721細胞增殖，與對照組比較，差異具有顯著性(P<0.01)，白花丹醌處理細胞24 h后，其抑制細胞增殖作用明顯增強。此外，抑制作用隨白花丹醌作用濃度的增加與時間的延長而加強，呈時間-劑量依賴關系。為避免高濃度白花丹醌未知細胞毒性的影響，后續實驗濃度選擇3 μmol·L-1，處理時間為24 h。

3.2白花丹醌對SMMC-7721細胞形態的影響透射電鏡結果顯示，對照組的SMMC-7721細胞形態沒有明顯變化，凋亡形態不明顯，仍具有完整的細胞膜和核膜，內質網、中心體清晰可見，分布均勻的核染色質，無凝集固縮的現象，胞質中可見初級自噬小體形成(Fig 1A、1B)。白花丹醌組細胞則出現了一系列凋亡形態，核染色質濃縮成幾個不同大小的塊,其中有一些是聚集，一些分布在細胞核的核膜皺褶,胞質濃縮，細胞器正常，分布相對集中，有時可見空泡在細胞質中，胞質中分布大量自噬小體(Fig 1C、1D)。

3.3白花丹醌對SMMC-7721細胞自噬蛋白LC3表達的影響Fig 2的細胞免疫熒光結果顯示，相較于溶劑對照組，白花丹醌處理組SMMC-7721細胞LC3蛋白紅色熒光相對聚集，熒光斑點增多，表達水平有所增高，而溶劑對照組胞質內LC3紅色熒光較少，并呈現相對彌散的狀態。形態學結果提示，白花丹醌處理后細胞自噬小體增多，可促進自噬。

Tab 2 Inhibitory effect of plumbagin on SMMC-7721 cells detected by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 1 Morphological observation of SMMC-7721 cells

A:Control(scale bar=1 μm); B:Control(scale bar=500 μm); C:Plumbagin(scale bar=1 μm); D:Plumbagin(scale bar=500 μm).

Fig 2 Immunofluorescence detection of autophagy protein LC3(×400)

3.4白花丹醌對SMMC-7721細胞Beclin1、Atg7、Atg5mRNA表達的影響如Fig 3所示，白花丹醌組細胞Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的表達均明顯升高，與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。提示白花丹醌可能通過上調細胞自噬相關基因Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的表達，誘導細胞的凋亡與自噬。

3.5白花丹醌對SMMC-7721細胞自噬相關蛋白表達的影響如Fig 4所示，當白花丹醌與凋亡抑制劑Z-VAD-FMK聯合使用時，白花丹醌能明顯提高自噬蛋白Atg5、Atg7、LC3-Ⅱ、Beclin1的表達水平。與溶劑對照組相比，單用白花丹醌組的蛋白表達增加，與單用白花丹醌組相比，Z-VAD-FMK+白花丹醌組的表達明顯增加，差異均具有顯著性(P<0.05)。如Fig 5所示，與溶劑對照組比較，白花丹醌處理組LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、Atg5的表達增高；與單用白花丹醌組相比，3-MA+白花丹醌處理組LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、Atg5的表達明顯降低(P<0.01)。結果提示，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK增強了白花丹醌對人肝癌細胞的自噬誘導作用，抑制凋亡可增強白花丹醌誘導的SMMC-7721細胞自噬，而自噬抑制劑3-MA減弱了白花丹醌對人肝癌細胞的自噬誘導作用。

Fig 3 Effect of plumbagin on the autophagy related gene

**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of Z-VAD-FMK inhibitor pretreatment on autophagy proteins of SMMC-7721

1:Control; 2:Z-VAD-FMK; 3:Plumbagin;4:Plumbagin+Z-VAD-FMK.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsplumbagin.

Fig 5 Effect of 3-MA inhibitor pretreatment on autophagy proteins of SMMC-7721

1:Control;2:3-MA;3:Plumbagin;4:Plumbagin+3-MA.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsplumbagin.

4 討論

白花丹醌的抗腫瘤活性是研究熱點之一。在非小細胞肺癌的研究中發現，白花丹醌阻滯細胞于G2/M期，并增加細胞系中活性氧的水平；通過減少Akt和mTOR的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，劑量依賴性地誘導自噬；同時，自噬的抑制或誘導增強白花丹醌誘導的細胞凋亡[5]。另有研究顯示，白花丹醌對胃癌、乳腺癌有一定的抑制作用，它可以使細胞趨化因子受體CXCR4的表達下降，而此作用可抑制胃癌細胞和乳腺癌細胞的遷移、侵襲[6]。此外，在口腔癌的研究中，我們發現白花丹醌通過PI3K/Akt/mTOR通路，誘導細胞凋亡和自噬，且p38 MAPK也參與白花丹醌在SCC25細胞中的凋亡和自噬誘導作用[7]。目前，靶向凋亡和自噬是癌癥治療中的潛在戰略[8]。細胞自噬是一種自噬廣泛存在于真核細胞內的高度保守的降解程序，其通過吞噬和降解活細胞中故障的細胞器和蛋白質，維持細胞穩態和基因組完整性[9]。在自噬起始階段，自噬體的形成與胞質可溶形式的 LC3-I向膜結合形式的LC3-Ⅱ的轉換有關[10]。Atg4蛋白酶將合成的LC3蛋白分離為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，其分散于胞質中并相互轉化，LC3-Ⅰ可以通過偶聯形式與磷脂酰乙醇胺結合，共同構成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ穩定位于自噬體的內外膜之間，被溶酶體溶解后消失，因此可作為自噬體的標記蛋白。本實驗免疫熒光檢測發現，白花丹醌處理的細胞LC3蛋白紅色熒光相對聚集，熒光斑點增多，表達水平有所增高，DAPI染核后細胞核增大。從電鏡觀察的細胞形態變化分析，白花丹醌處理后細胞出現凋亡形態，核染色質固縮，聚集分布在細胞核的核膜皺褶,胞質濃縮并分布大量自噬小體。提示在白花丹醌作用下，SMMC-7721細胞發生凋亡時細胞核變大，染色質固縮，使細胞吸收物質能力加強。此外，細胞接受自噬誘導信號后，在胞質中形成類似脂質體的膜結構，并不斷擴張延伸，吞噬細胞器，形成自噬體。作為自噬體的標記蛋白，LC3-Ⅱ蛋白表達水平的明顯提高提示SMMC-7721細胞中自噬體的大量形成，電鏡形態學觀察證實了這一結論。表明白花丹醌具有誘導肝癌細胞凋亡和促進自噬的作用。

研究發現，在受到不同環境的影響因素下，細胞凋亡和自噬行為可以發生互相促進或者拮抗改變。在通常情況下，細胞蛋白上的Atg7、Beclin1基因被敲除，或者使用3-MA時，caspase的效力就會減弱，與此同時，細胞凋亡的發生率也會降低[11]。許多體內外研究已初步證實，通過抑制自噬(HCQ、CQ、3-MA)或敲除Atg，均可增強多腫瘤的治療有效率[12-13]。部分自噬發生于凋亡前，并能進一步上調細胞凋亡相關蛋白的活性[14]。MCF7細胞被喜樹堿作用時，細胞內線粒體的位置形成一大片自噬泡樣結構；當使用自噬抑制劑時，細胞內部的線粒體膜的去極化過程增強，caspase-9活性升高，并加快細胞凋亡進程[15]。本研究免疫印跡結果顯示，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK增強了白花丹醌對人肝癌細胞的自噬誘導作用。我們進一步研究發現，白花丹醌誘導人體肝癌細胞發生自噬的作用可被自噬抑制劑3-MA削弱。因此，我們推測白花丹醌通過上調細胞自噬相關基因和蛋白表達水平，誘導細胞的凋亡與自噬。

綜上所述，白花丹醌可上調肝癌細胞中自噬基因與蛋白的表達水平，促進細胞凋亡和細胞自噬性死亡。此外，抑制凋亡能增強白花丹醌促進細胞自噬，但白花丹醌誘導肝癌細胞凋亡和自噬相互調節的具體機制仍有待進一步研究。本研究為白花丹醌臨床治療肝癌的應用發展提供了理論和實驗依據。