中藥復方多糖對不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞免疫活性的影響

劉曉婷，朱曉慶，楊 莉，馬 昭，喬彥杰，張保軍，谷新利，商云霞

(石河子大學 動物科技學院，新疆石河子 832003)

近年來，由于抗生素的濫用，病原體的變異，強毒株的出現等原因，在畜禽生產中普遍存在疫苗接種效果不佳或免疫失敗等問題。有臨床實踐表明，疫苗與免疫佐劑或免疫增強劑配合使用，是疫苗發揮良好防疫效果的有效手段之一。中藥多糖是從中草藥中提取出的具有免疫增強、抗感染、抗病毒及調節造血功能等多種生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，體內殘留量低，具有開發成療效確定、性質穩定及毒副作用小的免疫增強劑的前景[1]。多糖類物質是一種T細胞依賴性抗原，能被MHC II類分子處理和呈遞，進而被TCR識別，參與機體細胞免疫，亦能有效激活B淋巴細胞，誘導特異性抗體產生[2]。目前已發現上百種中藥多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗感染等多種生理活性，其免疫調節作用是當前研究的熱點之一。

主要組織相容性復合體(MHC)參與機體內、外抗原的呈遞，影響機體對疾病的抵抗力，是動物抗病育種的主要候選基因群之一[3]。有研究表明，雞MHCB-Lβ基因多態性對機體免疫反應具有廣泛的免疫調節作用，且與禽類對傳染性疾病的抗性高度相關[4-5]。朱曉慶等[6]研究發現，MHCB-LβII基因HinII位點的多態性能夠影響中藥復方多糖有效免疫劑量的篩選。由于雞MHCB-LβII基因多態性的存在，使得MHC II類分子接納與遞呈抗原肽有一定的選擇性，導致不同基因型個體對同一抗原表現出免疫應答強弱的差異。另外，中醫藥自古講求用藥個體化，因此中藥多糖作為調節機體免疫的外源性抗原之一，根據機體遺傳變異的特性給予不同劑量的中藥多糖，對保障疫苗效力、增強動物機體免疫力及提高其存活率有著重要意義。

本試驗擬排除因MHCB-LβII基因多態性而導致的不同基因型個體免疫應答能力的差異，確定中藥復方多糖能顯著增強雞機體免疫力的最佳劑量，從而為臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

中藥復方多糖由石河子大學中獸醫學研究室提供。復方由當歸、黨參、川芎、熟地、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補骨脂與黃芪11味中藥按一定配比組成，經水提—醇沉法得到中藥復方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附樹脂吸附，最終得到質量分數為77.10%的精制復方多糖。用滅菌超純水將復方多糖配制成50 mg/mL(高劑量)、25 mg/mL(中劑量)和12.5 mg/mL(低劑量)3個質量濃度，4 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素(IL-15)ELISA試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司；雞傳染性法氏囊病毒抗體(IBDV Ab)試劑盒購于江蘇綠葉生物科技有限公司；雞新城疫病毒(La Sota株)、傳染性支氣管炎病毒(M41株)二聯滅活疫苗，購自普萊柯生物工程股份有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗(La Sota 株+H120株)及雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)均購自哈藥集團生物疫苗有限公司；禽流感二價滅活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)購自哈爾濱維科生物技術開發公司。

1.3 試驗動物及分組

500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉市某一孵化場。根據MHCB-LβII基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測結果分組，再將各組分為高、中、低劑量中藥多糖組和空白對照組。分別于8日齡肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中藥復方多糖和生理鹽水，每只0.2 mL，連續注射7 d。

所用試驗雞1日齡馬立克疫苗噴霧免疫(于孵化場進行)，7日齡新、傳二聯活疫苗點眼免疫，21日齡新、傳二聯活疫苗點眼與新、傳二聯滅活苗肌注免疫，14日齡法氏囊疫苗滴口免疫，28日齡禽流感二聯滅活苗免疫。在相同條件下常規飼養，飼養條件、營養水平和飼養管理均一致，飼養期為7周，整個試驗期雞群健康狀況良好。

1.4 PCR-SSCP基因型檢測

1.4.1 基因組DNA的提取 翅下靜脈采血每羽0.2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20 ℃冷凍保存。用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存，備用。

1.4.2 引物設計與合成 根據GenBank中收錄的雞MHCB-LβII基因序列(NO.M29763.1)，應用Oligo軟件設計引物，引物序列為上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 PCR擴增 PCR擴增體系20 L：2×PCR Mix 10 L，模版DNA 2 L，上、下游引物各0.5 L，ddH2O 7 L。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94變性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，32個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 擴增產物由20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察并拍照。

1.4.4 PCR-SSCP分析及序列測定 取3 L PCR產物加7 L 變性上樣緩沖液[體積分數為98%去離子甲酰胺、10 mmol/L EDTA (pH 8.0)、0.5 g/L溴酚藍]，98 ℃變性10 min，變性結束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10 %聚丙烯酰胺凝膠[m(Acr)∶m(Scr)=29∶1]電泳檢測，300 V電壓預電泳10 min，120 V電泳14 h后，固定、銀染、顯色，判定基因型，拍照保存。各取3個不同基因型個體的PCR產物進行純化回收，送華大基因科技股份有限公司進行測序，對PCR-SSCP分型結果進行進一步驗證。

1.5 檢測項目及方法

每組隨機抽取5只試驗雞，于21、27、35、42、49日齡翅下靜脈采集非抗凝血3 mL，37 ℃靜置1 h，分離血清，測定血清中IL-1β、IL-10、IL-15的質量濃度和IBDV 抗體效價(均嚴格按照試劑盒說明書進行操作)。

1.6 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析和多重比較，以“平均數±標準差”表示數據。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

用所設計的引物對基因組DNA進行擴增，取所得PCR產物5 L于20 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，擴增產物檢測結果如圖1所示。由圖1可看出，所設計引物的擴增結果較好，片段長度與預期238 bp大小一致，條帶清晰，無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。

2.2 SSCP檢測

對所有DNA樣本的PCR產物進行SSCP多態性檢測，發現所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

M. Trans DNA maker I；1～7. 不同樣本個體MHCB-LβII基因擴增產物MHCB-LβIIgene amplification product of different sample individual

圖1MHCB-LβII的PCR擴增結果
Fig.1ThePCRamplificationresultsofMHCB-LβII

1、6、8、10.BC型 BC genotypes；2、4、7、9.BB型 BB genotypes；3、5：AA型 AA genotypes

2.3 不同基因型測序結果

選取不同基因型個體的PCR產物各3個，純化后送華大基因科技股份有限公司進行測序。結果顯示，在擴增位點有3種等位基因，分別為A、B和C，基因型有AA、BB和BC型，未檢測到AB和CC型。其中AA型與GenBank(No.M29763.1)發表的序列一致，定義為野生型。BB型與AA型相比有一處T1722C的單堿基突變，BB型與BC型相比有一處A1967T單堿基突變。

2.4 中藥復方多糖對不同基因型雞血清中IL-1β、IL-10和IL-15質量濃度的影響

2.4.1 對IL-1β質量濃度的影響 由表1可知，與對照組相比，高、中、低3個劑量的中藥復方多糖均能顯著提高不同基因型雞血清中IL-1β 的質量濃度，但不同基因型雞中最有效地提高其血清中IL-1β 質量濃度所需的中藥復方多糖劑量不同。其中，AA基因型雞中，各日齡中劑量多糖組血清中IL-1β的質量濃度顯著高于高、低劑量組(P<0.05)；BB基因型雞，各日齡高劑量多糖組血清中IL-1β的質量濃度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞，除27日齡高劑量多糖組血清中IL-1β 的質量濃度顯著高于低劑量組外，其余日齡各劑量多糖組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 對IL-10質量濃度的影響 由表2可知，與對照組相比，高、中、低3個劑量的中藥復方多糖均能顯著降低不同基因型雞血清中IL-10 的質量濃度。其中，AA基因型雞中，21、27和35日齡時，中劑量多糖組血清中IL-10的質量濃度顯著低于高、低劑量組(P<0.05)，42日齡時，中劑量多糖組低于高、低劑量組，但無顯著水平(P>0.05)；BB基因型雞中，除49日齡外，其他各日齡高劑量多糖組血清中IL-10顯著低于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，各劑量多糖組間血清中IL-10無顯著差異(P>0.05)。

2.4.3 對IL-15質量濃度的影響 由表3可知，與對照組相比，高、中、低3個劑量的中藥復方多糖組均能顯著提高不同基因型雞血清中IL-15 的質量濃度。在AA基因型雞中，27、35和42日齡時中劑量多糖組血清中IL-15質量濃度顯著高于高、低劑量組(P<0.05)，其他各日齡均高于高、低劑量組，但無顯著差異(P>0.05)；在BB基因型雞中，27、35和42日齡高劑量多糖組血清中IL-15 質量濃度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；在BC基因型雞中，各劑量多糖組間血清中IL-15質量濃度無顯著差異(P>0.05)。

2.5 中藥復方多糖對不同基因型雞血清中IBDV抗體效價的影響

由圖3可知，在傳染性法氏囊疫苗首免后7～35 d，試驗組及對照組雞血清IBDV抗體效價均呈升高趨勢，且與對照組相比，首免后13～35 d，高、中、低3個劑量的中藥復方多糖組均能顯著提高不同基因型雞血清中IBDV抗體效價，但不同基因型雞中，最有效提高其血清中IBDV 抗體效價的中藥復方多糖劑量不同。其中，AA基因型雞中，中劑量多糖組雞血清中IBDV 抗體效價顯著高于高、低劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量多糖組雞血清中IBDV 抗體效價顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，各劑量多糖組間雞血清中IBDV 抗體效價無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-1β的質量濃度Table 1 Serum levels of IL-1β in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

注：同基因型組中，同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Notes: In the same genotype group,different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-10的質量濃度Table 2 Serum levels of IL-10 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

表3 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-15的質量濃度Table 3 Serum levels of IL-15 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

圖3 不同基因型雞血清中IBDV抗體效價的比較Fig.3 Comparison of serum titers of IBDV antibodies in different genotypes of hens

3 討 論

雞MHCB-LβII基因豐富的多態性與機體的免疫性狀相關，能引起不同個體對相同抗原的不同的免疫反應[5]。研究表明，不同MHCB-LβII基因型雞對腸炎沙門氏菌、流感性布魯氏桿菌、綿羊紅細胞、禽流感和新城疫等的抗體滴度，及機體內淋巴細胞活性與細胞因子質量濃度等有所不同[7]。李福偉等[5]對3個地方雞種的MHCB-LβII基因遺傳變異與綿羊紅細胞、禽流感和新城疫等免疫性狀進行分析，發現個體甚至品種水平上存在免疫能力的差異。楊紅洋等[8]研究表明，不同MHCB-LβII基因型白羽肉雞血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和TNF-α的質量濃度不同。本試驗的空白對照組中，不同MHCB-LβII基因型雞血清中IL-1β、IL-10和IL-15質量濃度及IBDV抗體效價均有不同，提示MHCB-LβII基因的多態性與部分機體免疫活性具有相關性，能夠導致機體免疫功能具有個體差異。

細胞因子是由細胞分泌的一類能夠執行信號傳導的蛋白活性分子，可促進靶細胞的增殖、分化和成熟，在抗感染、調節機體的免疫應答和炎癥反應中起著重要的作用[9]。IL-1β是IL-1的主要亞型之一，具有高度生物活性，可以誘導淋巴細胞的增殖分化，刺激抗體產生，調節免疫作用等[10]。IL-10是一種由Th2細胞產生的抑制炎癥應答的免疫抑制細胞因子，其能夠通過降低抗原提成細胞(APC)表面MHC II分子及CD80+和CD86+等共刺激分子的表達，抑制Th1細胞產生IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)等促炎因子等各種途徑降低APC抗原提成能力，間接降低T細胞的激活，誘導T細胞的免疫耐受[11-12]。IL-15是機體重要的促炎因子，其受體分布于樹突細胞、自然殺傷細胞及CD8+T細胞，不僅可激活先天性免疫反應，而且對后續的獲得性免疫具有進一步的調控作用[13]。

研究表明，植物多糖能夠通過TLR4、TLR2受體激活免疫細胞內信號通路提高轉錄水平，促進細胞因子的分泌，從而發揮免疫調節作用[14]。李馨[15]研究表明，北冬蟲夏草多糖可以增加脾臟IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達量且隨劑量的增加而增加，從而增強機體免疫力。江澤波等[16]研究表明，豬苓多糖可通過TLR4信號通路活化M1巨噬細胞，劑量依賴性的上調IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌量，從而起到增強機體免疫力的效應。馬振乾[17]研究表明，沈氏免疫增強劑能抑制雛雞血清中IL-10的分泌，從而降低其在血清中的質量濃度。王永偉[18]研究表明，雞IL-15能夠維持IBDV VP2蛋白誘導的中和性抗體的持續時間。本研究發現，中藥復方多糖組各基因型雞血清中IL-1β和IL-15的質量濃度與對照組比較均有顯著提高，與李馨、江澤波等報道多糖能夠上調IL-1β mRNA表達量和IL-1β 分泌量的結果相似。但本研究中復方多糖對提高血清IL-1β 的不同基因型雞最佳劑量不同，除對BB基因型雞呈劑量依賴性提高血清中IL-1β 外，對AA和BC基因型雞血清中IL-1β 并不呈劑量依賴性提高。同時中藥復方多糖組與對照組相比均能顯著降低各基因型雞血清中IL-10的質量濃度，此結果與馬振乾等的研究一致。出現不同劑量中藥復方多糖對調節雞血清中細胞因子的最適基因型不同的原因可能是：不同MHCB-LβII基因型雞機體的免疫系統對中藥多糖類外來抗原的感知存在數量與濃度上敏感性的差異，過高或過低劑量的中藥多糖均不會產生較好的免疫應答，從而引起細胞因子質量濃度的差異。

在通過疫苗接種的方式對傳染性法氏囊疾病進行防治的同時，輔以免疫增強劑可有效提高疫苗接種的成功率，法氏囊抗體效價是反應法氏囊疫苗免疫后雞特異性免疫功能的指標。王宏軍[19]以飼料添加劑的方式投喂不同劑量的五味子多糖，發現多糖能顯著提高新城疫疫苗與傳染性法氏囊疫苗抗體效價，增強雛雞的特異性免疫。楊靖松等[20]通過飲水給予不同濃度的黨參粗提物，發現其能提高青腳麻雞血清中IBDV的抗體效價，且以中劑量藥效為佳。王福傳等[21]研究表明，以黃芪、黨參、當歸、白術、茯苓、砂仁、陳皮和甘草組成的復方中藥免疫增強劑能夠有效提高蛋雞血清中IBDV抗體效價。本研究結果顯示，與對照組相比不同劑量的中藥復方多糖均可顯著提高IBDV抗體效價，與王宏軍、楊靖松、王福傳等研究結果一致。但在同一基因型同一時間內，不同劑量的中藥復方多糖組中，雞血清中IBDV 抗體效價不同，這可能與MHCB-LβII基因多態性使機體存在免疫應答能力的個體差異，導致機體同一劑量中藥復方多糖組中，提高雞血清中IBDV 抗體效價最適基因型不同。與此同時在本試驗中發現，隨著日齡的增加雞血清中IBDV 抗體效價逐漸上升，在首免后13～20 d上升速度最快，而首免后20～35 d上升速度較慢，且不同復方多糖劑量組中雞血清中IBDV 抗體效價上升速度略有不同。其原因一方面可能與法氏囊活疫苗抗體消長規律有關，在法氏囊首免后2周左右可以產生大量抗體。另一方面可能與中藥復方多糖在機體內的代謝過程有關。在此過程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被 MHC class II 類分子提呈給 T 細胞而發揮免疫效應。多糖的濃度不同，且機體對多糖降解、吸收和代謝速度的不同，多糖在體內被降解成小分子糖的種類和數量的不同， 以及MHC class II 類分子提呈多糖分子的數量與能力不同，導致機體血清中IBDV 抗體效價上升速度不同。

從上述試驗研究結果可以看出，不同MHCB-LβII基因型雞個體之間存在免疫應答能力的差異，且在不同基因型雞中，最有效地提高機體免疫力的中藥多糖劑量略有不同。而本次試驗中，僅僅研究了京紅1號蛋雞，且雞的數量及免疫相關指標均較少，所以要確定中藥復方多糖最適免疫劑量的篩選是否受雞基因多態性的影響，還需增加雞的品種，擴大試驗雞的數量，增加體內、體外免疫指標，進行深入研究。