豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

袁 莉，楊順利，尚佑軍，賈懷杰，景志忠，劉湘濤，蔡建平,尹雙輝

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730046)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，除北美洲和大洋洲外幾乎遍及全世界，是危害養(yǎng)豬業(yè)安全的重要疫病之一。CSFV屬于黃病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒屬 (Pestivirus) 成員，基因組為單股正鏈RNA，大小約12.3 kb，僅編碼 1 個(gè)開(kāi)放性閱讀框(ORF)[1-2]。CSFV基因組編碼C(P14)、E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55)4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，C為核衣殼蛋白，其他均為囊膜糖蛋白。E2是CSFV最重要的具有免疫原性的蛋白之一，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染，是研究新型基因工程疫苗和血清學(xué)抗體檢測(cè)方法的首選靶蛋白。E0不僅具有RNase催化活性，在病毒復(fù)制和致病力方面也發(fā)揮作用，并能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是CSFV的重要免疫相關(guān)抗原。CSFV感染或疫苗免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗CSFV強(qiáng)毒攻擊。因此，E0蛋白在重組疫苗和診斷方法研制方面同樣具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。E1蛋白功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，它常與E2形成異源二聚體并包埋在病毒囊膜內(nèi)層，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，目前還未發(fā)現(xiàn)病毒免疫血清中有E1抗體的存在，但對(duì)病毒的毒力有一定影響，并參與病毒粒子基本結(jié)構(gòu)的組成[4-5]。C蛋白是CSFV編碼的第一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，在病毒的增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，C蛋白上存在的抗原表位對(duì)T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有重要作用，但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體[7]。己經(jīng)證實(shí)與CSFV同科的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的C蛋白具有免疫原性[8]，丙型肝炎病毒的C蛋白已經(jīng)被用于臨床感染治療和疫苗研發(fā)[9]。由此推測(cè)CSFV的C蛋白可能具有與之相似的免疫學(xué)特性和功能，可以嘗試?yán)肅蛋白作為包被抗原建立ELISA檢測(cè)方法。本研究以大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)、純化和鑒定后具有良好免疫反應(yīng)性的CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E0和C作為包被抗原，分別建立CSFV血清抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，同時(shí)結(jié)合已經(jīng)建立的重組E2蛋白作為抗原的間接ELISA檢測(cè)方法，分別對(duì)豬瘟疫苗免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，分析疫苗免疫后血清中針對(duì)3種結(jié)構(gòu)蛋白的抗體消長(zhǎng)變化特點(diǎn)，為臨床豬瘟疫苗免疫程序的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Coster公司；脫脂奶粉為Difco公司產(chǎn)品；HRP酶標(biāo)記抗體、E0和C蛋白抗體陽(yáng)性血清，豬瘟陰、陽(yáng)性血清以及PCV2、PRRSV、PRV和BVDV陽(yáng)性血清均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所豬禽消化道感染和黏膜免疫研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫 選取由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所畜禽重要人獸共患病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育的11頭豬瘟抗體陰性蕨麻豬作為試驗(yàn)動(dòng)物，按照疫苗使用說(shuō)明接種，其中8頭用豬瘟兔化弱毒活疫苗免疫，頸部肌肉深部注射，3頭作為陰性對(duì)照。免疫前采血(0天)，隨后分別在免疫后第7、14、21、28、35和50天采集抗凝血和非抗凝血各1 份，非抗凝血室溫靜置凝集析出血清，分裝后-20 ℃保存。

1.2.2 豬瘟疫苗免疫豬外周血淋巴細(xì)胞中 E2基因的RT-PCR檢測(cè) 從免疫后定期采集的抗凝血中分離外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增CSFV E2基因[10]。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，并切膠回收目的片段進(jìn)行序列測(cè)定與分析。

1.2.3 CSFV E2抗體檢測(cè) 用已建立的重組E2蛋白作為抗原的間接ELISA方法檢測(cè)免疫后采集的血清樣品，每份樣品做3個(gè)重復(fù)[10]。

1.2.4 E0和C抗原制備 CSFV 重組E0蛋白的表達(dá)純化和抗原制備參照文獻(xiàn)[11]。C抗原制備簡(jiǎn)要過(guò)程如下：0.5 mmol/L IPTG 37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)C蛋白，超聲波裂解菌液。向超聲波裂解后的沉淀中加入8 mol/L 尿素，室溫作用 30 min 裂解沉淀，7 000 r/min離心20 min，收集上清；將純化后的蛋白轉(zhuǎn)移至含 8 mol/L尿素的復(fù)性液(20 mmol/L Tris·HCl pH 8.0，0.5 mmol/L argnine，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L GSH， 1 mmol/L GSSG)中進(jìn)行透析，然后將復(fù)性液換成含有1 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG的 Tris·HCl(pH 8.0)繼續(xù)透析6 h，最后用PBS透析過(guò)夜，離心并收集上清，并進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳和Western blot鑒定。

1.2.5 間接ELISA檢測(cè) 分別用純化的E0和C作為包被抗原，建立CSFV-E0和CSFV-C抗體間接ELISA檢測(cè)。方法如下：用碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 稀釋抗原，包被ELISA反應(yīng)板，每孔100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜，1×PBST (pH 7.4) 洗板4次，拍干；每孔200 μL封閉液，室溫作用30 min，洗板同前；用血清稀釋液 (1×PBST, 50 g/L 脫脂奶粉，pH 7.4) 稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清和待檢血清樣品，每孔100 μL，37 ℃孵育60 min，洗板；1×PBST稀釋HRP標(biāo)記抗豬二抗，每孔100 μL，37 ℃作用60 min，洗板；每孔100 μL TMB-H2O2-檸檬酸鹽緩沖液，37 ℃避光作用15 min；每孔100 μL 2.0 mol/L H2SO4終止液，混勻，讀取450 nm吸光度值。

1.2.6 間接ELISA條件優(yōu)化 采用棋盤滴定法滴定抗原、血清和酶標(biāo)二抗的工作濃度。用碳酸鹽緩沖液將抗原分別做1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200倍稀釋并包被ELISA反應(yīng)板；豬瘟陰、陽(yáng)性血清用血清稀釋液做1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 稀釋；酶標(biāo)二抗以1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀釋。按照“1.2.5”操作步驟，測(cè)定每孔OD450nm值，根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清OD450nm/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD450nm(P/N)最大原則，確定抗原、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度，并以此法優(yōu)化間接ELISA各步反應(yīng)的條件。

1.2.7 間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 利用實(shí)驗(yàn)室保存的40份豬瘟陰性血清樣品作為樣品盤，確定間接ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測(cè)定的OD450nm吸光度值，計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，樣品OD450nm

1.2.8 ELISA-C和ELISA-E0抗體間接ELISA檢測(cè)的特異性和敏感性 分別利用 2 種間接ELISA檢測(cè)PCV2、PRRSV、PRV和BVDV陽(yáng)性血清，同時(shí)以CSFV陰性和陽(yáng)性血清作為對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，確定ELISA方法的特異性。將E0和C蛋白抗體陽(yáng)性血清做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀釋，研究2種間接ELISA方法的敏感性。

1.2.9 CSFV E0和C 抗體檢測(cè) 利用建立的CSFV-E0和CSFV-C抗體間接ELISA方法分別對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的免疫豬血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟疫苗免疫豬外周血淋巴細(xì)胞中 E2基因檢測(cè)

在疫苗免疫后第 7 天和第 14 天，從 8 頭試驗(yàn)豬外周血淋巴細(xì)胞中均擴(kuò)增到大小約700 bp 的 E2基因片段(圖1)，目的片段切膠回收進(jìn)行序列測(cè)定，在GenBank中比對(duì)證實(shí)為豬瘟疫苗株 E2基因。從14 d以后的樣品中均未擴(kuò)增得到此基因片段。

M.DNA marker DL 2000; 507～958. 8頭疫苗免疫豬編號(hào) 8 vaccinated pigs

2.2 CSFV-E2抗體消長(zhǎng)特征

用CSFV-E2抗體間接ELISA方法檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血清樣品，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)樣品值(S)/陰性值(N)>2.1時(shí)，CSFV-E2抗體判定為陽(yáng)性，反之為陰性。檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組均為陰性。試驗(yàn)組在免疫后第7天時(shí)血清E2抗體陽(yáng)性，在免疫后第21天時(shí)達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降，總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)(圖2)。

2.3 CSFV-E0抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

2.3.1 抗原、血清和酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度 利用棋盤滴定法確定E0蛋白的最佳包被質(zhì)量濃度為2.09 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和田間檢測(cè)血清樣品稀釋度均為1∶60，酶標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶100。

2.3.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)40份CSFV抗體陰性豬血清的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得平均值X=0.31，標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.044，計(jì)算得X+2SD=0.40，因此，本次檢測(cè)中血清樣品OD450 nm<0.40 為抗體陰性，反之為陽(yáng)性。

圖2 豬瘟疫苗免疫后CSFV E2抗體變化特征Fig.2 Dynamics of E2 antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

2.3.3 特異性和敏感性 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCV2、PRRSV、PRV和BVDV陽(yáng)性血清與E0抗原無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明本方法具有良好的特異性(表1)。用該方法檢測(cè)1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀釋的陽(yáng)性血清時(shí)，當(dāng)稀釋度為1∶640 時(shí)，結(jié)果為陰性，表明敏感性良好。

表1 CSFV-E0抗體間接ELISA檢測(cè)的特異性試驗(yàn)Table 1 Specificity results of CSFV-E0 indirect ELISA

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。下同。

Note: The data in the table are repetitive “mean±standard deviation”. The same below.

2.3.4 CSFV E0抗體的產(chǎn)生特征 用CSFV-E0抗體間接ELISA方法檢測(cè)疫苗免疫后不同時(shí)間收集的血清樣品，結(jié)果顯示，對(duì)照組OD450nm值均小于陰陽(yáng)性臨界值 0.38，均為陰性。試驗(yàn)組在疫苗免疫后第 7 天即可檢測(cè)到E0抗體，在第 21 天時(shí)達(dá)到最高水平，免疫 21 d后有所下降并最終趨于穩(wěn)定(圖3)。

圖3 豬瘟疫苗免疫后CSFV E0抗體變化特征Fig.3 Dynamics of E0 antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

2.4 CSFV-C抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

2.4.1 SDS-PAGE和Western blot鑒定重組C蛋白 表達(dá)的C蛋白以包涵體形式存在，大小約20 ku。Western blot結(jié)果顯示，其能夠被CSFV C陽(yáng)性血清識(shí)別(圖4)。

2.4.2 抗原、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度 利用棋盤滴定法確定C蛋白最佳包被質(zhì)量濃度為1.59 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和待檢測(cè)血清樣品最適稀釋度均為1∶80，酶標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶350。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein marker; 1. 純化前的重組C蛋白 The recombinant C protein before purification; 2. 純化后的重組C蛋白 Purified recombinant C protein; 3. 重組C蛋白的Western blot檢測(cè) Analysis C protein with Western blot

圖4SDS-PAGE和Westernblot鑒定重組C蛋白
Fig.4AnalysisofrecombinantCproteinwithSDS-PAGEandWesternblot

2.4.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)40份CSFV抗體陰性豬血清樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算得平均值X=0.51，標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.077，X+2SD=0.66，因此，血清樣品的OD450nm<0.66時(shí)判為抗體陰性，反之為陽(yáng)性。

2.4.4 特異性和敏感性 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCV2、PRRSV、PRV和BVDV陽(yáng)性血清與C蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，表明特異性良好(表2)；用CSFV-C間接ELISA方法檢測(cè)連續(xù)稀釋的CSFV陽(yáng)性血清，當(dāng)稀釋至1∶320時(shí)，結(jié)果為陰性，表明敏感性良好。

表2 CSFV-C抗體間接ELISA檢測(cè)的特異性試驗(yàn)Table 2 Specificity results of CSFV-C indirect ELISA

2.4.5 CSFV C抗原的抗體消長(zhǎng)規(guī)律 用CSFV-C抗體間接ELISA方法檢測(cè)豬瘟疫苗免疫的血清樣品，結(jié)果顯示，對(duì)照組OD450nm值均小于陰陽(yáng)性臨界值0.63，均為陰性。試驗(yàn)組疫苗免疫后第7天檢測(cè)到抗C蛋白抗體，在第28天時(shí)抗體轉(zhuǎn)陰(圖5)。

圖5 豬瘟疫苗免疫后CSFV C抗體消長(zhǎng)規(guī)律Fig.5 Dynamics of C antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

3 討 論

E2是CSFV最重要的免疫功能蛋白，含有B、T細(xì)胞表位，可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，是主要的保護(hù)性抗原[12-14]。E2蛋白N 端氨基酸殘基 690～866包含4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域，分別是 A、B、C 和D，其中A、B、C區(qū)對(duì)于中和抗體的產(chǎn)生發(fā)揮主要作用[15]。豬感染CSFV或疫苗免疫后也可以產(chǎn)生針對(duì)E0的中和抗體，E0作為CSFV的次要免疫相關(guān)抗原，在CSFV感染過(guò)程中必不可少。C蛋白是構(gòu)成病毒粒子的一種外殼蛋白，在病毒繁殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此可以通過(guò)檢測(cè)疫苗免疫后血清中E2、E0和C蛋白的抗體產(chǎn)生情況反映CSFV疫苗的免疫效果。

目前，國(guó)內(nèi)CSF防控主要還是采取豬瘟兔化弱毒疫苗預(yù)防接種，定期對(duì)免疫后豬群進(jìn)行抗體檢測(cè)，評(píng)估疫苗免疫效果，改進(jìn)和優(yōu)化免疫程序，有助于豬瘟的防控。在豬瘟病毒血清抗體檢測(cè)實(shí)際工作中，因ELISA方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間、特異性和靈敏性良好及適用于大規(guī)模樣本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床使用最廣泛的技術(shù)手段。已有諸多利用 E2 或 E0 蛋白作為抗原的 ELISA 方法被研發(fā)出來(lái)[16-19]，這些方法在CSF防控或消滅中發(fā)揮重要作用。

本研究中，豬瘟疫苗免疫后，僅從免疫豬第7天和第14天的外周血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到CSFV E2基因片段，21 d及以后的時(shí)間點(diǎn)均未能檢測(cè)到，說(shuō)明本次試驗(yàn)中，疫苗毒在豬體內(nèi)存在時(shí)間不超過(guò)21 d，再次證明豬瘟弱毒疫苗安全性良好，不存在持續(xù)性感染的危險(xiǎn)[20]。在用CSFV-E2抗體間接ELISA方法對(duì)疫苗免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，免疫后第7天E2抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，在第21天時(shí)達(dá)到最高峰，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道基本一致[21-23]。采用建立的CSFV-E0抗體和CSFV-C抗體間接ELISA方法分別檢測(cè)疫苗免疫后不同時(shí)間點(diǎn)血清樣品，結(jié)果顯示，在CSFV 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體中，C抗體產(chǎn)生最早，消失最早。C蛋白作為病毒的核衣殼蛋白，其抗體主要存在于病毒感染早期，隨著C抗體水平的下降，E2和E0抗體水平開(kāi)始上升，C抗體消失后，E2和E0抗體達(dá)到最高水平，對(duì)免疫豬發(fā)揮保護(hù)作用。本次動(dòng)物試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，單次疫苗免疫后第7天即可檢測(cè)到E2、E0和C蛋白的相應(yīng)抗體，豬體免疫應(yīng)答產(chǎn)生迅速，但抗體水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均會(huì)有所降低，因此臨床上有必要根據(jù)抗體變化適時(shí)加強(qiáng)免疫，確保豬群安全。

2017年，中國(guó)歷史上首個(gè)豬瘟基因工程疫苗，即豬瘟病毒 E2 蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗(Rb-03株) 獲得批準(zhǔn)，該重組疫苗只誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生抗E2蛋白抗體，因此，可以通過(guò)檢測(cè)針對(duì)CSFV其他蛋白的抗體來(lái)區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，該疫苗為中國(guó)的豬瘟凈化奠定基礎(chǔ)。本研究建立的檢測(cè)CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E0和C抗體的ELISA方法可以作為鑒別感染和免疫的候選方案，為中國(guó)豬瘟的凈化提供技術(shù)支持。