藏藥“扎頡俄色”總黃酮醇質體制備工藝的優化

西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

西南民族大學少數民族藥物研究所民族藥物新藥研發課題組在高原民族藥(藏藥)生發復方“扎頡俄色”的前期研究中發現，“扎頡俄色”有效部位總黃酮提取物(ZJESF)較原復方具有更好的局部活化毛囊促進毛發生長的作用[1-3]。但是，ZJESF溶解性較差，皮膚透過性差，藥物直接應用于皮膚的療效不明顯。醇質體(Ethosomes)是由磷脂、高濃度(20%～45%)乙醇和水組成，具有脂質雙分子層囊泡結構的一種新型柔性脂質體[4]。易于透過皮膚屏障，有效地攜帶藥物到達皮膚深層細胞，促進藥物透皮吸收，因而可顯著提高藥物的經皮滲透速率以及藥物在皮膚內的滯留量，是一種較為理想的透皮載體。因此，本研究計劃將ZJESF制備成一種新型局部外用醇質體[5]，為進一步開發出一種安全、有效、生物利用度高、具有毛囊皮脂腺靶向作用的治療脫發疾病的新型外用制劑提供質量可靠的醇質體中間體。本文進行ZJESF醇質體的處方、制備工藝優化和質量評價研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(DAD檢測器、Waters 2996 Empower色譜工作站，美國Waters公司)；MS-2000激光粒度分析儀(英國malvern公司)；KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；JSM-7500F掃描電鏡(日本電子株式會社)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海廣英儀器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；TGL-16B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；SENCO-R型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)。

1.2 材料 甲醇(AR)、膽固醇(AR)、蛋黃卵磷脂(AR)、三氯甲烷(AR)、無水乙醇(AR)、二氯甲烷(AR)，甲基纖維素(AR)、羧甲基纖維素鈉(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、磷酸氫二鉀等均為成都市科龍化工試劑廠生產；ZJESF(總黃酮)(批號：20160508，總黃酮含量為60%，西南民族大學少數民族藥物研究所提供)；俄色黃酮(SFH)對照品(批號：20160106，純度>98%，西南民族大學少數民族藥物研究所提供)。甲醇為色譜純(迪馬公司)。

2 方法與結果

2.1 SFH含量測定方法的建立及驗證

2.1.1 供試溶液的制備

2.1.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取SFH對照品100 mg，置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得到濃度為 1 mg/mL 的儲備液。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 精密量取ZJESF醇質體溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，搖勻，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲破膜，搖勻， 即得供試品儲備液。

2.1.1.3 空白溶液的制備 采用注入法制備不含ZJESF的空白醇質體，精密量取ZJESF醇質體溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，搖勻，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲破膜，搖勻， 即得空白液溶。

2.1.2 檢測波長的確定 取對照品儲備液，以甲醇做作為空白，用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm范圍內進行掃描，根據掃描結果選擇 285 nm 作為檢測波長。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenor Luna C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm)；柱溫：25℃；檢測波長：285 nm；流動相：甲醇-水(2∶3)。體積流量為1.0 mL/min，進樣量：10 μL。

2.1.4 專屬性考察 取“2.1.1”項下標準品溶液、空白溶液及供試品溶液，0.45微孔濾膜過濾，HPLC法測定其吸收峰。結果，在“2.2.3”項色譜條件下，空白脂質體無吸收，說明輔料對主藥的測定無干擾。結果 SFH的分離度大于1.5，理論塔板數大于 10 000。

2.1.5 精密度實驗 取“2.1.1 .1”項下SFH對照品儲備液1 mL，置于 20 mL 量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，0.45 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進樣，于 1 d 內連續進樣6次，測定測定其峰面積，結果顯示RSD%值為0.24(n=6)，表明方法精密度良好。

2.1.6 線性關系考察 精密量取“2.1.1.1”項下SFH對照品儲備液，并將儲備液稀釋成質量濃度為10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的一系列標準溶液，0.45 μm的微孔濾膜過濾，按色譜條件進樣， HPLC法測定其峰面積，濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，作標準曲線，考察其線性關系。得線性方程為Y=3×107X+865115(R2=0.9995)，結果表明：SFH在0.010～0.100 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.7 穩定性考察 精密量取“2.1.1.1”項下標準品和SFH對照品儲備液，室溫放置1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 后，0.45 μm微孔濾膜過濾，分別進樣10 μL進行測定，記錄峰面積，結果，兩者RSD%分別為1.3%和2.4%，表明標準溶液在 72 h 內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取6份已知含量的醇質體溶液，分別精密加入SFH對照品20.0 mg，制備加樣回收供試品溶液，照“2.1.3”項下色譜條件進樣測定含量，計算回收率。平均回收率98.0%，RSD%為1.6。

2.1.9 重復性實驗 取同一份 ZJESF醇質體，按照供試品溶液的制備方法平行制備 6 份，分別注入液相色譜儀，驗證方法的精密度，測定得其RSD為0.94%。

2.2 ZJESF醇質體的制備工藝和處方研究及結果

2.2.1 ZJESF醇質體的制備 根據參考文獻[6-7]和預試結果采用注入法制備醇質體。通過單因素篩選工藝條件，得醇質體制備工藝如下：精密稱取處方量的ZJESF、蛋黃卵磷脂、膽固醇，加入處方量無水乙醇溶解并定容，構成有機相；另取一定量純化水加入混合容器中，置于磁力攪拌器(700 r/min)上，構成水相。將有機相用注射器針頭緩慢加入至水相中，注完后繼續攪拌2 h，攪拌溫度保持在50℃，自然冷卻后超聲20 min， 即得[8]。

2.2.2 ZJESF醇質體的處方及工藝優選 依據預實驗考察結果，選擇對ZJESF醇質體制劑包封率影響較大且規律不明顯的3個因素，即卵磷脂與藥物比(A)、卵磷脂與膽固醇比(B)，醇濃度(C)、3個因素都取3個水平，并以包封率為主要優化指標，在“2.2.1”的基礎上采用L9(34) 正交實驗進行制備工藝及處方的篩選[9]。

取蛋黃卵磷脂與ZJESF比例(w/w)、蛋黃卵磷脂與膽固醇比例(w/w)、含醇量3個因素水平進行處方及工藝優選，因素水平見表1，正交實驗結果見表2。

表1 因素水平表

根據正交實驗設計結果分析表明，按積差R的大小排列，各因素對ZJESF醇質體包封率的影響程度依次為： A = C>B。蛋黃卵磷脂與藥物比(A)和醇濃度(C)，兩者影響程度相當，而蛋黃卵磷脂與膽固醇比(B)影響程度最小。所以，結合單因素考察結果，A2B2C1為最優條件，得到最佳處方及工藝為：ZJESF為5%、蛋黃卵磷脂與藥(ZJESF)比為8∶1(w/w)、含醇量為45%(v/v)、蛋黃卵磷脂與膽固醇比為3∶1(w/w)PBS溶液。精密稱取處方量的ZJESF、蛋黃卵磷脂、膽固醇，加入處方量無水乙醇溶解并定容，構成有機相；另取一定量純化水加入混合容器中，置于磁力攪拌器(700 r/min)上，構成水相。將有機相緩慢加入至水相中，加完后繼續攪拌2 h，攪拌溫度保持在50℃，自然冷卻后超聲20 min，即得。

表2 試驗設計和結果

2.2.3 粒徑和Zeta電位的測定和形態觀察 取優化方案制備的ZJESF醇質體適量，適當稀釋后，采用激光粒徑分析儀分別測定ZJESF醇質體的以粒子體積為權重的重量平均粒徑分布和Zeta電位。由粒徑分布和Zeta電位可以得出，ZJESF醇質體的平均粒徑為(296.6±5.8) nm，(PDI值0.26)，Zeta電位為(-14.4±2.3) mV。

取優化方案制備的ZJESF醇質體少量，用PBS溶液稀釋200倍，將稀釋樣品超聲5 min，使其均勻分散；用毛細管將樣品滴于導電膠上，置于烤燈下烘干(溫度低于50℃)；將導電膠粘到載物臺上，固定好并噴金；置于JSM-7500F型掃描電鏡下觀察其外觀形態。制備的ZJESF醇質體為均一乳白色混懸液，無沉淀，無分層。如圖1所示，該ZJESF醇質體外觀呈球狀或類球型，粒徑大小適中。

2.2.4 醇質體包封率的測定 采用超離心法測定醇質體的包封率：精密移取ZJESF醇質體 2 mL于離心管中，于4℃下離心， 10 000 r/min 離心 30 min，取上清液，補足溶劑(與處方量相同濃度的乙醇水溶液)，同條件下再次離心，合并上清液測定上清液ZJESF量(mL)；另取醇質體混懸液0.1 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，超聲15 min 破膜，測得總藥量(m)，包封率按下式計算： p 包封率 (%) = (1- mL/m)×100%。采用高速離心法測定最佳處方最佳制備工藝制備的醇質體三批，得到其包封率分別為72.4%、72.6%、71.6%，因此得到SFZH醇質體平均包封率為72.2%。

2.2.5 工藝驗證試驗 三批ZJESF醇質體(工藝驗證規格為：50 mL)樣品工藝驗證試驗結果見表3。試驗結果表明，三批ZJESF醇質體樣品的平均包封率為71.3%，RSD為1.5%(n=3)，與正交實驗值相當，表明工藝合理、可行。

表3 工藝驗證試驗結果 (n=3)

3 討論

影響醇質體包封率的因素有很多，如藥物的性質、藥物與脂質的比例、醇和脂質的種類和用量、制備方法等。其中，醇質的制備方法最常用的為注入法和薄膜分散法。考慮到薄膜分散法會存在有機溶劑殘留、制膜薄厚不均勻及不宜工業化生產的問題，本實驗選用注入法。以ZJESF醇質體的包封率為指標，通過單因素考察和正交優化法進行實驗設計，確定ZJESF醇質體制備的最佳處方及最佳工藝參數[6]。由單因素考察可知：藥物量、超聲時間、攪拌速度及制備溫度對包封率、粒徑、電位的影響不是很大，綜合考慮各方面的因素，藥物量定為5%，超聲時間定為20 min，攪拌速度定為700 r/min。卵磷脂與主藥比例、卵磷脂與膽固醇比例、含醇量對包封率影響較大且規律不明顯，將3個因素作為正交實驗設計優化法考察的因素，繼續對其進行考察。