層層自組裝復合電極用于檢測牛奶中三聚氰胺

李萌萌， 李冬迪， 羅仙科， 郭 卓

(沈陽化工大學 材料科學與工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

三聚氰胺(Melamine,C3H6N6)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，作為一種化工原料常被添加到塑料、纖維和膠水中以提高產(chǎn)品性能.由于三聚氰胺中氮的含量約占66 %(質(zhì)量分數(shù))[1]，比蛋白質(zhì)還高，并且價格低廉[2]，所以，一些不法商販為了個人利益將其加到乳制品或食品中，造成高蛋白的假象.長期攝入三聚氰胺不僅會導致生殖、泌尿系統(tǒng)的損害、衰竭[3]，甚至還會造成死亡.因此，準確快速地檢測出牛奶中的三聚氰胺對于保證食品安全具有非常重要的意義.

目前，檢測三聚氰胺的方法有很多，比如：高效液相色譜法(HPLC)[4],氣相/液相色譜-質(zhì)譜分析法(GC/LC-MS)[5-6]，聯(lián)酶免疫吸附測定法(ELISAS)[7]及毛細管電脈質(zhì)譜分析法(CE-MS)[8]等.這些方法的弊端在于需要貴重的檢驗設備和復雜的預處理過程，不適用于常規(guī)的檢測.而電化學檢測方法是一種操作簡單、靈敏度高的分析方法，它可以用于食品中三聚氰胺的檢測[9].

金納米粒子具有良好的生物相容性、良好的光學和電學特性，被廣泛應用于三聚氰胺的檢測.例如， Su 等[10]制備金納米粒子，用3-巰基丙磺酸鹽修飾后加入預處理過的含有三聚氰胺的嬰兒奶粉溶液中，與奶粉中三聚氰胺結(jié)合后，溶液由紅色變成了藍色，可以對三聚氰胺進行檢測；Ai等[11]采用MTT(1-(2-巰基乙基)-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮)修飾的金納米探針測定三聚氰胺，具有較高靈敏度；Liang等[12]采用巰基乙胺修飾金納米探針，實現(xiàn)了奶粉中三聚氰胺的檢測.

氧化石墨烯(GO)是由碳原子構(gòu)成二維片狀結(jié)構(gòu)，其表面含有很多的含氧官能團，在水中易分散，比表面積大，具有很好的導電性能，在生物檢測和電容器方面具有廣泛的應用.本實驗采用的是電化學方法.首先，將氧化石墨烯涂到電極上，制備GO/GCE修飾電極；然后，利用層層自組裝方法，把1，4-二硫蘇糖醇(DTT)、金納米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)組裝到GO/GCE修飾電極表面，制備了GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE復合電極；此復合電極與三聚氰胺之間產(chǎn)生氫鍵作用，可以對牛奶中痕量的三聚氰胺產(chǎn)生響應.同時，該方法簡單方便，成本低，易于推廣，可以實現(xiàn)對三聚氰胺的高選擇、高靈敏的檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4)、L-半胱氨酸(L-Cys)、檸檬酸鈉、納米石墨粉均購于上海阿拉丁試劑有限公司；1,4-二硫代蘇糖醇(DTT)、鐵氰化鉀均購于國藥集團化學試劑有限公司(上海)；三聚氰胺、濃硫酸、雙氧水、鹽酸、高錳酸鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、丙酮和氯化鉀試劑均購于天津化學試劑公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)按標準配制成不同 pH 溶液.所有試劑均為分析純.實驗用水為二次蒸餾水.玻碳電極的處理：將電極在麂皮上用氧化鋁粉拋光，依次用丙酮、乙醇、蒸餾水各超聲10 min，烘干，備用.

Autolab-PGSTAT302N 電化學工作站購于瑞士萬通中國有限公司.三電極系統(tǒng)：工作電極為修飾的玻碳電極，輔助電極為鉑絲，參比電極為飽和甘汞電極.檢測方法有循環(huán)伏安法(CV)、微分脈沖伏安法(DPV)和電化學阻抗(EIS).NICOLET-560 型紅外光譜儀購于美國 Nicilet 公司，光譜區(qū)域 400～4 000 cm-1.透射電子顯微鏡(H-600)，日本株式會社日立制作所.

1.2 實驗過程

1.2.1 氧化石墨烯(GO)的制備

采用傳統(tǒng)Hummers[13]法來制備GO.GO的制備：在冰水浴條件下，往三口瓶中加入0.6 g納米石墨(40 nm)和1.0 g NaNO3，再倒入35 mL冷藏的濃H2SO4，攪拌40 min；再稱取3 g KMnO4，緩慢加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌2 h；撤掉冰浴并將反應體系溫度升至35 ℃，在此溫度下繼續(xù)攪拌30 min；接著將150 mL去離子水緩慢加入體系中，將反應體系升溫至98 ℃，繼續(xù)攪拌15 min；最后，將反應完的溶液緩慢倒入提前預熱的200 mL去離子水中攪拌，隨后向溶液中滴加雙氧水至沒有氣泡產(chǎn)生，靜置分層將上層清液倒出，下層溶液用蒸餾水洗至中性，離心分離，得到GO分散液.

1.2.2 納米金的制備

納米金溶液的制備[14]：取1 mL摩爾分數(shù)為0.01 %的氯金酸(HAuCl4)溶液加入到100 mL去離子水中，然后向其中迅速加入1 mL摩爾分數(shù)為1 %的檸檬酸鈉水溶液，在100 ℃的條件下加熱攪拌30 min；溶液會從淺藍色變成紫紅色，最后形成酒紅色金納米粒子(AuNPs)溶液.

1.2.3 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE納米修飾電極的制備

將上述制備好的氧化石墨烯配成1 g/L溶液，涂在已處理好的玻碳電極上，真空干燥；然后采用自組裝的方法，將氧化石墨烯修飾的玻碳電極浸泡在濃度為50 mmol/L DTT 的乙醇溶液中12 h，然后用蒸餾水沖洗；再將電極浸入到制備好的金納米粒子溶液中，讓電極在4 ℃冰箱內(nèi)組裝24 h，蒸餾水清洗；再浸泡在濃度為20 mmol/L的L-Cys溶液中12 h，取出電極后用超純水沖洗干凈后待用.

1.2.4 奶粉樣品的處理

精密稱取牛奶樣品，加入乙腈，充分振蕩，然后添加一定量三聚氰胺標液，用pH=7.0的PBS緩沖溶液稀釋至100 mL，在10 000 r/min速度下離心10 min，取上清液作為提取液.取提取液1 mL，用5 mmol/L K3[Fe(CN)6](pH=6.80)溶液稀釋到10 mL，采用DPV法進行檢測，并計算標準樣品的回收率.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯和Au納米粒子的表征

圖1 為氧化石墨烯和金粒子的透射電子顯微鏡圖.從圖1可以看出：氧化石墨烯成片層結(jié)構(gòu)，有很多小褶皺，具有大的比表面積；金納米粒子的粒徑大約是50 nm.

圖1 氧化石墨烯和金納米粒子的TEM

2.2 電極的層層自組裝

由圖2(a)可知：石墨粉被氧化后表面包含了很多的含氧官能團，在3 400 cm-1處出現(xiàn)了一個較寬、較強的吸收峰，這是—OH 的伸縮振動峰；在 1 723 cm-1、1 386 cm-1和1 050 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別為C==O伸縮振動、—OH 的變形振動以及C—O的伸縮振動[15].當將GO/GCE電極浸泡在DTT中時，如圖2(b)，—OH的吸收峰變強，并且在2 556 cm-1和600 cm-1出現(xiàn)了新的吸收峰，分別為—SH和—C—S—的振動峰，說明DTT組裝在GO上[16].在GO/GCE電極浸入金納米溶膠后[圖2(c)],—SH從2 556 cm-1移動到2 543 cm-1，說明Au納米粒子與—SH發(fā)生了配位.電極浸泡在L-Cys溶液中，如圖2(d)所示，新出現(xiàn)的吸收峰為1 651 cm-1和1 400 cm-1，分別是—N—H的彎曲振動及—C—N—的伸縮振動[17]，說明各物質(zhì)層層自組裝在玻碳電極上.當電極與Melamine發(fā)生氫鍵作用時[圖2(e)]，在3 469 cm-1、3 421 cm-1、3 135 cm-1處出現(xiàn)了N—H的伸縮振動峰[18]，1 554 cm-1是C==N的伸縮振動峰[19],同時，1 723 cm-1處C==O的峰變?nèi)酰f明三聚氰胺與L-Cys形成了氫鍵.

(a) GO (b) GO-DTT (c) GO-DTT-AuNPs(d) GO-DTT-AuNPs-L-Cys (e) GO-DTT-AuNPs-L-Cys-Melamine

2.3 修飾電極的電化學性能

如圖3所示，在1.0 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(包含0.5 mol/L KCl)的混合溶液中，在-0.2～0.6 V 的電壓范圍，以100 mV/s的掃描速率內(nèi)對不同的修飾電極進行CV掃描，并將各CV曲線進行對比.圖中裸電極(曲線a)有一對清晰的氧化還原峰，ΔEp為0.13 V.當修飾氧化石墨烯后(曲線b)，氧化還原峰明顯變?nèi)?這是因為氧化石墨烯表面有很多含氧基團，阻礙了電子轉(zhuǎn)移.對于電極GO/DTT/GCE(曲線c)，當加入DTT以后，氧化還原峰繼續(xù)變小，ΔEp增大.這是因為DTT是惰性傳質(zhì)層[20]，阻礙了電子傳遞到玻碳電極表面上[21].當組裝Au膠體后(曲線d)，由于Au具有非常好的導電能力，氧化還原峰電流增大，促進了[Fe(CN)6]3-/4-電子之間的轉(zhuǎn)移.當組裝L-Cys后(曲線e)，L-Cys電子傳遞能力較差，曲線的氧化還原峰電流值降低.此結(jié)果說明各組分很好地組裝在一起，相互作用，形成了很好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極.

圖4為不同電極的EIS圖，阻抗的檢測頻率范圍在0.1～105Hz.根據(jù)Nyquist(EIS)圖在高頻處半圓的直徑和等效電路圖，可以大約計算出電子轉(zhuǎn)移電阻[9].曲線a為空白電極，它的電子轉(zhuǎn)移電阻為194 Ω；電極修飾GO后(曲線b)，其半圓直徑變大，導電的速率降低，電阻為343 Ω；與GO/GCE相比，電極GO/DTT/GCE阻抗增大(曲線c)，這是因為DTT阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，降低了其電導率.組裝金膠體后(曲線d)，半圓的直徑明顯變小，其電阻降低至129 Ω；曲線e為GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE復合電極的阻抗，導電性能比GO/DTT/AuNPs低，電子轉(zhuǎn)移的阻抗值為241 Ω.說明了此電化學傳感器的電極通過層層組裝，很好地結(jié)合在一起，并且形成了良好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極，與CV檢測的結(jié)果一致.

(a) bare/GCE (b) GO/GCE (c) GO/DTT/GCE(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e) GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

(a) bare/GCE、(b) GO/GCE、c.GO/DTT/GCE、(d) GO/DTT/AuNPs/GCE (e)GO/DTT/AuNPs/L-cys/GCE

2.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對三聚氰胺的檢測原理

層層自組裝(LBL) 以正負電荷間的靜電作用為驅(qū)動力，通過帶相反電荷的單元交替沉積構(gòu)筑逐層組裝多層膜.當用組裝好的GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修飾電極來檢測三聚氰胺溶液時，工作原理如圖5所示.

圖5 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對三聚氰胺的檢測原理

三聚氰胺沒有電化學活性，但能與L-Cys上的羧基發(fā)生氫鍵作用，生成的物質(zhì)具有電化學響應；并且隨著三聚氰胺濃度的增加，產(chǎn)生的電化學響應增大，因此，可用于三聚氰胺檢測.

2.5 反應條件的優(yōu)化

2.5.1 pH對峰電流的影響

圖6是5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺在不同pH(5.8～8.0)的磷酸鹽緩沖溶液中的DPV響應.pH在5.8～7.0范圍內(nèi)，在pH達到7.0時，峰電流達到最大值；pH繼續(xù)增大，峰電流逐漸變小.所以，當pH=7.0時檢測三聚氰胺的結(jié)果最佳.

圖6 不同pH對峰電流的影響

2.5.2 DDT濃度對峰電流的影響

從圖7中可以看出：在DTT濃度比較低時，電流隨著DTT濃度的增加而增大，在DTT濃度為50 mmol/L時電流達到最大；隨后，隨著DTT濃度的增加而電流逐漸降低.這是因為，隨著DTT濃度的增加，有更多的DTT分子與氧化石墨烯自組裝到一起，有更多的巰基與Au配位，進而與更多的三聚氰胺分子產(chǎn)生響應；但是，隨著DTT濃度的進一步增大，電極傳輸電子的能力降低，從而電流逐漸減小.所以，在后面的實驗中選用DTT的濃度為50 mmol/L.

圖7 DDT濃度對峰電流的影響

2.5.3 L-Cys濃度對峰電流的影響

從圖8中可以看出：電流隨著L-Cys濃度的增加而增大，在L-Cys濃度為20 mmol/L時達到最大，隨后隨著L-Cys濃度的增加電流逐漸降低.這是因為，三聚氰胺與L-Cys上的羧基發(fā)生氫鍵作用，生成的物質(zhì)具有電化學響應，隨著L-Cys濃度的增加，更多的L-Cys分子與三聚氰胺發(fā)生反應，產(chǎn)生的電化學響應增大；但是隨著L-Cys濃度的繼續(xù)增大，反應生成的物質(zhì)使電極厚度增加，阻礙了電子的傳輸，使電流下降；在L-Cys的濃度是20 mmol/L時達到最大值.在后面的實驗中選用L-Cys的濃度為20 mmol/L.

圖8 L-Cys濃度對峰電流的影響

2.5.4 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時間對峰電流的影響

復合電極與三聚氰胺作用時間對峰電流的影響如圖9所示.

圖9 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時間對峰電流的影響

從圖9中可以看出：GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極與三聚氰胺作用時間達到12 h時，產(chǎn)生的電流響應最大.這是因為，隨著電極與三聚氰胺作用時間的增加，更多的三聚氰胺分子配位到電極表面，使電流增加；但是，隨著作用時間繼續(xù)增加，三聚氰胺在電極表面飽和，繼續(xù)增加作用時間，電流反而減小.所以，在后面的實驗中選用作用時間為12 h.

2.6 三聚氰胺的檢測

在0.1 mol/L pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE修飾電極對1.0×10-7～1.0×10-3mol/L的三聚氰胺溶液進行DPV檢測，結(jié)果如圖10所示.

a 1.0×10-7 mol/L b 8.0×10-7 mol/Lc 3.0×10-6 mol/L d 5.0×10-6 mol/Le 1.0×10-5 mol/L f 2.0×10-4 mol/Lg 6.0×10-4 mol/L h 1.0×10-3 mol/L

從圖10曲線a～h可以看出：隨著三聚氰胺濃度的不斷增大，氧化峰的電流也在逐漸增大.三聚氰胺濃度與峰電流值在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L和1.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)分別成線性關(guān)系，其線性方程為：

Ipa=11.17+0.85c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-7～1.0×10-5mol/L，R=0.995)

(S/N=3)

Ipa=13.48+0.02c

(Ipa:μA，c:μmol/L)

(1.0×10-5～1.0×10-3mol/L，R=0.992)

(S/N=3)

其最低檢測限為1.0×10-8mol/L.

2.7 電極的重復性和穩(wěn)定性

為了檢測GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極的重復性，對pH=7.0， 5.0 × 10-4mol/L的三聚氰胺溶液檢測8次.8次檢測的峰電流相對標準偏差為2.42 %，說明該電極具有良好的重現(xiàn)性.再將制備好的電極在空氣中放置21 d，然后進行檢測.檢測結(jié)果比初始結(jié)果下降了2.8 %，表明該修飾電極的穩(wěn)定性良好，使用壽命長，可以廣泛地應用.

2.8 實際樣品的檢測

考察GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE電極對牛奶中三聚氰胺的檢測.采用標準加入法，在牛奶樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，經(jīng)預處理后，用DPV法測試其濃度，計算回收率，結(jié)果見表1.

表1 修飾電極檢測牛奶樣品中三聚氰胺的回收率

3 結(jié) 論

首先制備了氧化石墨烯修飾電極，然后將1，4-二硫蘇糖醇、金納米粒子、L-半胱氨酸通過層層自組裝方法組裝在氧化石墨烯修飾電極表面上，用來檢測牛奶中三聚氰胺含量.結(jié)果表明，由于修飾電極與三聚氰胺之間有氫鍵作用，使響應電信號增強，峰電流值變大.該電極制備經(jīng)濟簡單，檢測范圍在1.0 × 10-7～1.0 ×10-3mol/L，最低檢測限是1.0 × 10-8mol/L.該電極的重復性和穩(wěn)定性良好，可廣泛用于奶制品中三聚氰胺的檢測.