TLRs基因家族在鴨法氏囊中的表達模式及分子進化分析

甘心夢，陳凱文，劉賀賀，李彥瑩，王繼文，李 亮，白麗麗

(四川農業大學，畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室，成都 611130)

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)基因家族是機體最早被發現的一類模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，可以準確識別一種或多種病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，能啟動和調節機體的免疫應答，同時也是連接先天性免疫和獲得性免疫的關鍵環節[1-3]。根據脊椎動物TLRs基因家族的胞外結構域可以將其分為TLR1(1、2、6、10)、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7(7、8、9)、TLR11、TLR13(13、21)、TLR15八大亞家族[4]。不同物種TLRs基因家族在進化中保持著相似的結構和功能，但其成員組成差別大。果蠅有9種TLRs基因，哺乳動物有13種，其中TLR1～10能在人上特異性表達，小鼠上能表達12種TLRs(TLR1～9、TLR11～13)[5-6]，而雞和鴨均有10種TLRs基因，其中TLR15為禽類特有[7]。禽類TLRs基因家族廣泛分布于機體各組織器官中。在雞不同胚齡組織中，各TLRs基因的表達存在極顯著差異(P<0.01)[8]。TLR3和TLR7能介導鴨對病毒感染的先天免疫過程[9]。TLR4主要參與脂多糖(LPS)的識別，注射LPS能刺激雞小腦的TLR4極顯著上調(P<0.01)[10-11]。由此可見，分析組織器官中TLRs家族成員的表達變化可以為探究其功能提供依據。

法氏囊作為禽類特有的中樞免疫器官，是影響其發育、功能形成和免疫功能發揮的大量關鍵基因的聚集地[12]。在雞5胚齡時法氏囊開始發育，9～28日齡為生長高峰，56日齡后開始退化[13]。而鴨法氏囊在17周齡時開始退化[14]。研究發現，雞法氏囊中的TLR3和TLR15、TLR2a和TLR4基因分別在識別馬立克氏病毒和新城疫病毒中起著關鍵作用[15-16]。

基因家族各成員一般來源于祖先基因的基因重復以及分子進化[17-18]。基因重復導致了基因多樣化發展，而隨著新功能和基因缺失的增加，基因家族出現亞功能化，最終導致進化分歧[19-20]。在其他物種上，FoxO基因家族和Coq1基因家族等都在長期的進化過程中呈現出了不同形式的功能分化[21-22]。為探尋鴨TLRs基因家族各成員的功能差異，本研究擬檢測TLRs家族各成員mRNA在鴨法氏囊胚后發育各階段的相對表達模式，并結合分析啟動子區和編碼區的系統進化樹，以探討TLRs基因家族表達模式、功能分化與基因分子進化的關系，進一步為TLRs基因家族的研究分析提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取四川農業大學水禽育種場提供的0、2、4和6周齡的健康農華肉鴨(GF2)，每周齡公母各3只(共24只)，屠宰后采集法氏囊樣品，并用液氮研磨后放入-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴨法氏囊TLRs的定量引物設計 根據GenBank數據庫中鴨TLRsmRNA基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計TLRs基因編碼區定量引物(表1)，通過PCR擴增、克隆、測序，用Blast程序將測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行比對，檢測引物的正確性和特異性，包括鴨TLRs基因家族全部10個成員。

1.2.2 鴨法氏囊TLRs的PCR擴增和qRT-PCR反應 采用Trizol法提取鴨法氏囊的總RNA，檢測濃度和完整性后，反轉錄(試劑盒購自TaKaRa公司)合成模板DNA(cDNA)，稀釋后作為檢測模板在熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進行qRT-PCR反應，以β-actin為內參基因，每個樣品設3個重復，測定TLRs各成員的相對轉錄水平。

PCR反應體系為10 μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，各基因退火溫度如表1所示，退火時間30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環；72 ℃最終延伸10 min。

表1鴨TLRs基因和內參基因定量引物信息

Table1InformationofprimersofduckTLRsandreferencegene

基因名稱Gene name引物序列(5'→3')Primer sequence產物長度/bpProduct size退火溫度/℃Annealing temperatureTLR1aF: TGTCAGGAATTTGGGACCATR: GCTGTTAGACTTTGAGGCTTGT15860TLR1bF: TGTCCTTCATCTAACAGTCCCTR: TGCTCCTCGGCTCCATC22760.8TLR2aF: GACAATCTGTAAAGATGCTTGGCR: TCACACACATCTGGAATCTCACC16260TLR2bF: GTTGAGGTGGAGATGAAAGACTR: ACAGCCTGAAGATCCGTAAA14960TLR3F: ATGTCATGCAAACCTGACCAR: CCAGGGTCTTGAAAGGATCA23960TLR4F: GGTGCCACATCCATACAAR: CCAATCGGTAGGTCAGTCAG18160TLR5F: GATGCCATTTGGAACAGR: AACTACTACCATAACGAGGAC14160TLR7F: TGCTGTTATGAGCCACCTR: AACCAATTCTGTCATCACCC17260TLR15F: ATAGCGGAGGACACTTTCGGR: ATCTGAATGCCCAAGGAGC23363TLR21F: ACCTGGGCTTCTACCTCTTCACCR: GTCGTAGACGTAGCGCTCCTCCT16761.9β-actinF: GCTATGTCGCCCTGGATTTCR: CACAGGACTCCATACCCAAGAA16860

F.上游引物;R.下游引物

F.Forward primer;R.Reverse primer

qRT-PCR反應體系為20 μL：SYBR@Premix EX TapTM(2×) 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板DNA 2 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環；65～95 ℃按0.5 ℃增值進行熔解曲線分析。

1.2.3 構建TLRs編碼區和啟動子區系統進化樹TLRs基因序列均下載自NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。使用了人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)和鴨(Anasplatyrhynchos)的TLRs編碼區序列，選取轉錄起始位點前2 000 bp作為啟動子區序列。利用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)，Bootstrap分析重復數為1 000，構建TLRs基因家族系統進化樹，其余參數默認不變(表2)。

1.3 統計分析

qRT-PCR結果用Excel 2016整理，采用2-ΔΔC(T)方法計算，結果使用內參基因β-actin進行標準化校正。用Graphpad Prism 7.0繪圖，Mev軟件進行聚類分析，SPSS 22.0的ANOVA方法進行顯著性比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 鴨法氏囊胚后發育過程中TLRs的表達

PCR擴增試驗結果顯示，每個產物均得到單一目的條帶，且與預期片段長度一致(圖1)，說明定量引物特異性較好。通過PCR擴增試驗找到每個TLR定量引物的最適熔解溫度(表1)。從圖2可以看出，TLR2a的表達水平在鴨法氏囊胚后發育的W2和W6時期顯著高于W4時期(P<0.05)，其余TLRs各成員在鴨法氏囊胚后發育期的表達差異不顯著(P>0.05)。

表2系統進化樹參考基因信息

Table2Theinformationofreferencegenesofphylogenetictree

物種Species基因名稱Gene name染色體Chromosome編碼區登錄號Coding sequence accession No.啟動子區序列Promoter sequence登錄號Accession No.起始位點/bpStart position終止位點/bpEnd position人Homo sapiensTLR14NM_003263.3NC_000004.1238 798 83238 800 831TLR24NM_001318787.1NC_000004.1221 61923 618TLR34NM_003265.2NC_000004.12186 074 621186 076 620TLR49NM_003266.3NC_000009.12117 702 474117 704 473TLR51NM_003268.5NC_000001.11223 113 032223 115 031TLR64NM_006068.4NC_000004.1238 829 47438 831 473TLR7XNM_016562.3NC_000023.1112 865 58012 867 579TLR8XNM_016610.3NC_000023.1112 904 70812 906 707TLR93NM_017442.3NC_000003.1252 225 52952 227 528TLR104NM_001017388.2NC_000004.1238 775 59038 777 589小鼠Mus musculusTLR15NM_001276445.1NC_000071.664 927 23364 929 232TLR23NM_011905.3NC_000069.683 841 03983 843 038TLR38NM_126166.5NC_000074.645 403 14245 405 141TLR44NM_021297.3NC_000070.666 825 83266 827 831TLR51NM_016928.3NC_000067.6182 970 435182 972 434TLR65NM_011604.4NC_000071.664 955 56364 957 562TLR7XNM_001290755.1NC_000086.7167 330 004167 332 003TLR8XNM_001313760.1NC_000086.7167 263 752167 265 751TLR99NM_031178.2NC_000075.6106 220 704106 222 703TLR1114NM_205819.3NC_000080.650 356 01650 358 015TLR124NM_205823.2NC_000070.6128 618 456128 620 455TLR13XNM_205820.1NC_000086.7106 145 578106 147 577雞Gallus gallusTLR1a4NM_001007488.4NC_006091.469 961 23369 963 232TLR1b4NM_001081709.3NC_006091.469 953 09169 955 090TLR2a4NM_204278.1NC_006091.420 187 47720 189 476TLR2b4NM_001161650.1NC_006091.420 195 14320 197 142TLR34NM_001011691.3NC_006091.461 705 19761 707 196TLR417NM_001030693.1NC_006104.44 081 1144 083 113TLR53NM_001024586.1NC_006090.417 867 80717 869 806TLR71NM_001011688.2NC_006088.4123 414 224123 416 223TLR153NM_001037835.1NC_006090.43 023 9213 025 920TLR2111NM_001030558.1NC_006098.4389 044391 043

(轉下頁 Carried forward)

1013(scaffold)指TLR21基因在鴨第1013號scaffold上

1013(scaffold) refers to theTLR21 gene on duck’s No.1013 scaffold

圖1 TLRs的PCR擴增產物電泳結果Fig.1 The PCR amplification electrophoresis results of TLRs

同一基因在4個時期的表達中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences of the same gene expression among 4 periods (P<0.05)圖2 鴨法氏囊胚后發育中TLRs的表達情況Fig.2 The expression of TLRs in the postembryonic development stage of duck bursa of Fabricius

2.2 鴨法氏囊TLRs表達聚類分析

如圖3，TLR1a、TLR2a和TLR2b的表達模式相近，TLR3、TLR5和TLR15也接近，TLR1b和TLR21的表達模式相近，TLRs基因家族的表達模式可以分為兩大類：TLR1a、TLR4、TLR2a、TLR2b和TLR7為一類，其余的TLR3、TLR5、TLR15、TLR1b和TLR21歸為一類。

圖3 鴨法氏囊胚后發育期TLRs表達量熱圖Fig.3 The expression heatmap of TLRs in the postembryonic development stage of duck bursa of Fabricius

2.3 TLRs編碼區和啟動子區的系統進化樹

分析TLRs編碼區進化樹(圖4b)可以看出，人、小鼠、雞和鴨的TLRs基因較為對應的聚在同一分支上。TLR1(1a、1b)和TLR2(2a、2b)聚為一支，與禽類特有的TLR15距離較近；TLR3和TLR5在同一個分支節點上；TLR4和TLR21為單獨兩分支；雞和鴨的TLR7與人和小鼠的TLR7、TLR8、TLR9聚在同一支；禽類的TLR21與其他TLRs距離最遠。而基于TLRs啟動子區構建的系統進化樹無明顯規律(圖4a)。

3 討 論

在機體免疫應答反應中，TLRs基因家族是極為重要的模式識別受體，通過識別脂多糖、鞭毛蛋白、dsRNA等PAMPs在先天性免疫反應中扮演著重要角色[23]。TLRs基因家族的表達與其行使的功能緊密相關。TLR3和TLR7分別參與了雞法氏囊對傳染性法氏囊病毒和H9N2禽流感病毒的感染應答，表明TLRs在禽類免疫信號感知以及法氏囊免疫功能發揮等方面扮演了重要角色[24-25]。然而，最早發現的果蠅Toll基因被認為是一個發育調控蛋白，雞TLRs基因在10胚齡到2日齡期間存在明顯的表達變化，雛鴨免疫器官中TLRs的表達從33胚齡到1日齡呈顯著上升趨勢[26-28]。這些研究提示，TLRs基因家族的表達與胚胎發育調控和早期免疫功能有關。在胚胎發育階段，獲得性免疫尚未發育完全，先天性免疫系統已經建立了應對早期致病性攻擊的免疫準備[29]。

研究發現，TLRs基因在2～21日齡的雛雞上并不存在時期表達特異性[27]。在10和30日齡的雞法氏囊上也并無差異表達基因涉及到TLRs信號通路[30]。本研究結果與現有報道基本一致，除TLR2a外，其余TLRs成員在鴨法氏囊發育階段的表達均不存在顯著差異(P>0.05)，提示TLRs基因的表達情況基本穩定，可能不參與鴨法氏囊胚后發育調控過程。另外，禽類TLR2a能識別細菌細胞壁成分，功能與哺乳動物的TLR2和TLR4相近[31]。本研究中，TLR2a在4周齡鴨法氏囊的表達水平顯著低于2和6周齡(P<0.05)，這可能與該時期鴨法氏囊識別細菌的功能有關，然而僅檢測TLRs的表達水平并不能完全代表Toll樣受體蛋白的表達情況[32]，因此，TLR2a對4周齡鴨法氏囊的發育及功能有何影響還有待進一步研究。

基因家族的進化是由祖先基因通過重復和歧化進化而來，各成員可能具有相同或相關的功能[18]。同時基因的進化也會向著不同物種和種系特異性的方向發展，從而產生特有的基因[33]。Toll基因最初只具有促進機體發育的功能，而由于受到病原體介導的正向選擇壓力的作用，導致TLRs基因在不同物種的進化中出現差異[19]。本研究中，TLR1a和TLR1b、TLR2a和TLR2b具有較高的同源性，TLR3、TLR5和TLR15的遺傳距離較近，TLR21與其余TLRs的遺傳關系最遠。基因家族中各成員的表達模式比較可以為探究該基因家族的生理生化功能和基因功能分化提供重要信息[34]。如Lopes-Marques等[20]對ACSLs基因家族的研究發現，ACSL1a和1b、ACSL3a和3b、ACSL4a和4b的進化距離較近，其中ACSL3a和3b、ACSL4a和4b功能相似，而ACSL1a和ACSL1b的組織分布表達完全不同，提示其功能存在差異。結合分析TLRs的表達模式與序列進化發現，TLR2a和TLR2b，以及TLR3、TLR5和TLR15具有相似的表達模式和較近的遺傳距離，提示其可能具有相似的功能。鴨TLR1a和TLR1b的同源性較高，但表達模式不同，表明可能在基因進化過程中出現了功能分化。

A為TLRs啟動子區進化樹；B為TLRs編碼區進化樹，標記為TLRs各成員所在的亞家族A is phylogenetic tree based on TLRs promoter sequence; B is phylogenetic tree based on TLRs coding sequence, the TLRs included in each family are also labeled圖4 TLRs系統進化樹Fig.4 Phylogenetic trees of TLRs

啟動子區位于轉錄起始位點上游，是調控基因表達、決定基因活動的重要結構，TLRs各成員的表達模式差異是否與啟動子區的序列進化有關？為此，本研究對TLRs家族各成員啟動子區進行了聚類分析，未發現明顯規律，這可能是因為基因的表達與調控是一個復雜過程，涉及到了多個基因和多條信號通路，因此TLRs基因家族表達模式差異可能與啟動子區進化無關。

4 結 論

TLRs家族成員在鴨法氏囊中均有表達，且在胚后發育階段表達變化不明顯，提示TLRs家族成員可能不參與鴨法氏囊胚后發育調控過程；TLR2a和TLR2b，以及TLR3、TLR5和TLR15具有相似的表達模式和較近的遺傳距離，其功能可能相關；TLR1a和TLR1b雖然具有較高的序列相似性，但表達模式不同，可能出現了功能分化。研究排除了TLRs表達模式與啟動子區序列進化的聯系。