FSH對牦牛卵母細胞EGF、EGFR表達及其細胞凋亡的影響

何翃閎，潘陽陽，張慧珠，李 秦，王 萌，崔 燕，樊江峰，余四九

(甘肅農業大學動物醫學院 甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

牦牛是青藏高原重要的動物資源，是牛屬動物中唯一對低氧環境具有強適應能力的動物[1]，其繁殖力低下，體外卵母細胞成熟率和胚胎發育能力均較低，嚴重影響其體外受精、體細胞克隆等繁殖技術的發展[2]。成熟卵母細胞的產生對體外受精具有非常重要的作用，其位于原始卵泡中，由少量鱗狀顆粒細胞(granulosa cells, GCs)包圍的小卵母細胞形成[3-5]。生殖激素與顆粒細胞相結合可促進卵母細胞的發育，如促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黃體素(luteinizing hormone, LH)等[6]。FSH是由垂體前葉的促性腺激素產生的糖蛋白，對體內卵泡的生長具有重要作用[7]。卵母細胞在體外成熟期間FSH可促進卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)擴增和核成熟[8]，FSH還可使胚胎囊胚率和孵化囊胚率均有所增加[9]。Hiradate等[10]發現，SH和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)可通過MAPK依賴性途徑而調節神經降亞素(neurotensin, NT)的表達，而NT可以充當精子獲能的啟動子使其在雌性生殖道中發生頂體反應。Prochazka等[11]研究發現，PKA和MAPK14途徑對于FSH誘導表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的反式激活起著至關重要的作用。對FSH在卵母細胞發育中發揮作用的研究越來越多，有研究表明，卵母細胞中FSH可改變基因的表達模式[12]，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期血清中,FSH水平較高可能會導致卵母細胞的棕色透明帶厚度增加，胚胎質量降低，妊娠率降低[13]。FSH與卵泡中EGF相互作用以激活卵母細胞中磷脂酰肌醇3-磷酸/Akt級聯，以控制其翻譯和發育能力[14]。

有研究表明，牛卵母細胞早期凋亡與其發育能力有關[15]，FSH和EGF的協同作用可以更好地阻止豬顆粒細胞多層膜共培養中顆粒細胞的凋亡[16]。徐庚全等[17]研究表明，FSH可通過調節牦牛顆粒細胞的凋亡及分泌功能，在調控卵泡發育及排卵過程中發揮重要作用。B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 associated X,Bax)和B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)在調節細胞凋亡中起關鍵作用[18]，潘陽陽等[2]研究表明,EGF和EGFR作為牦牛COCs體外成熟過程中重要的自分泌因子，且外源的EGF可以顯著提高卵母細胞成熟率、卵裂率及囊胚率，其作用機制可能與調控凋亡相關基因Bax和Baxi表達有關。綜上表明，了解激素對生長因子的作用以及卵母細胞凋亡的影響，對提高卵母細胞質量和附植前胚胎的發育具有重要意義，但目前在國內外尚未見關于FSH對牦牛卵母細胞EGF、EGFR表達及其細胞凋亡的影響方面的報道，本試驗通過在牦牛卵母細胞體外培養，加入不同濃度的FSH，檢測卵母細胞成熟率，采用Real-time PCR、蛋白免疫印跡法和免疫熒光染色法檢測卵母細胞成熟過程中Bax和Bcl-2、EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表達動態，以期闡明FSH與EGF與EGFR的關系，為進一步探討FSH在牦牛生殖過程中發揮的作用以及EGF和EGFR對牦牛卵母細胞成熟和后期胚胎發育的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

促卵泡素(FSH)、EGF、雌二醇(E2)、促黃體素(LH)、透明質酸酶以及M199 培養液為Sigma公司產品，胎牛血清FBS購自Hyclone公司。微量樣品總RNA提取試劑盒(Omega)、兩步法反轉錄試劑盒(Promega)、SYBR Green II熒光定量PCR試劑盒(寶生物)，免疫熒光染色所用試劑購自南京碧云天生物公司，其他試劑均為國產分析純。EGF抗體(ab9862, Munich, Germany)、EGFR抗體(ab2430, Munich, Germany)、Bax抗體(ab77566， Munich, Germany)和Bcl-2抗體(ab117115, Munich, Germany)為Abcam公司產品，所有二抗為北京博奧森公司產品。熒光定量PCR儀(ABI ViiA7，Life technologies公司，美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 牦牛卵巢及卵母細胞的采集

牦牛的卵巢采自青海省西寧市樂家灣屠宰場。將從屠宰場采集的牦牛卵巢置于37 ℃生理鹽水中，4 h內帶回實驗室，用生理鹽水清洗3遍，用帶18G 針頭注射器采集卵巢表面直徑約3～10 mm卵泡，體視顯微鏡下挑選形態完好、細胞質均勻，周圍帶有3層以上致密卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用洗卵液(DPBS+5% FBS)清洗3遍后，備用。

1.3 卵母細胞體外成熟

配制卵母細胞成熟液(M199+10 mmol·L-1Hepes+10% FBS+1 μg·mL-1E2+1 mg·mL-1BSA)，分別加入不同濃度的FSH，使其最終濃度為0、2、5、10 μg·mL-1。將COCs隨機分為4組，分別放入含不同濃度FSH的卵母細胞成熟液中，于38 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中進行成熟培養，培養24 h后，將部分成熟COCs進行凍存和固定，每個試驗組重復5次。

1.4 卵母細胞成熟率統計

在光學顯微鏡下，觀察COCs的形態，根據卵丘細胞的擴張情況判斷卵母細胞的成熟。將成熟的COCs放入0.1%透明質酸酶中，用移液槍輕微吹打5 min，以去除卵丘細胞而得到裸卵，用玻璃針撥動其卵母細胞，根據第一極體排出來統計成熟卵母細胞(M II期)，每個試驗組重復5次。

1.5 RNA提取及反轉錄

將每個試驗組中的5個COCs用PBS清洗3次后，用微量樣品總RNA提取試劑盒提取總RNA，再用兩步法反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA[19]，放入-80 ℃保存備用。

1.6 qRT-PCR檢測Bax、Bcl-2、EGF和EGFR基因的表達

根據GenBank數據庫中檢索的牛EGF(AY192564)、EGFR(HM749883)、Bax(NM173894)、Bcl-2(NM001166486)和β-actin(JF830811)的序列，用Primer Premier 6.0 軟件設計了5對引物(表1)，引物均由上海華大基因科技有限公司合成。采用實時熒光定量PCR儀檢測EGF、EGFR、Bax和Bcl-2基因mRNA水平的表達。反應體系為20 μL：10 μL FastStart Master SYBR Green Mix，1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5 μL，無菌去離子水 7.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 s，95 ℃變性4 s，60 ℃退火(EGF、EGFR、β-actin)，57 ℃(Bax)和64 ℃(Bcl-2)退火20 s，72 ℃延伸 10 s，40個循環；每個樣品重復3次。

1.7 免疫熒光染色檢測EGF和EGFR蛋白的表達

將不同處理組的COCs用免疫染色固定液在室溫下固定1 h，然后在室溫條件下，用免疫染色洗滌液洗3次，用含0.2% TritonX-100 的免疫染色封閉液封閉1 h，將COCs置于用含2%BSA的PBS稀釋成5 μg·mL-1的一抗EGF和EGFR中(EGF和EGFR抗體分別是山羊和兔多克隆抗體)，在4 ℃孵育過夜，再用含2%BSA的PBS洗3次，先后移入含有APC標記的驢抗山羊抗體和FITC標記的山羊抗兔抗體中孵育2 h，清洗3次后，封片，再用熒光顯微鏡觀察并照相。同時，使用含有2%BSA的PBS替代陰性一抗作為對照組，其他步驟與試驗組保持一致。

1.8 Western blotting檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達

提取不同處理組的總蛋白，將其與上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，100 ℃煮10 min，冰上5 min，進行SDS-PAGE電泳；再用半干法將其轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉1.5 h(搖床振動，70 r·min-1)，用Bax和Bcl-2的抗體4 ℃孵育過夜，用二抗室溫孵育1.5 h，每步完成后，用TBST洗膜，每次洗3遍，每遍 5 min，最后用ECL避光顯色，X 光片顯影、定影，再掃描蛋白印跡條帶。試驗重復3次，對掃描的蛋白印跡條帶用Image J軟件進行圖像分析。

表1目的基因和內參基因引物序列

Table1Primersequencesoftargetandhouse-keepinggenes

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence位置/bpPosition退火溫度/℃Tm 產物大小/bpProduct length GenBank登錄號GenBank accession No.EGFF:GCAGTATCTTCTCACCATCAGCACR:AAAACCAGAGCCCCAAACAA706～89360188AY192564EGFRF:CTATGACCCTACCACCTACGAR:AAACTCACCGATTCCTATTCC738～94660209HM749883BaxF:TTTGCTTCAGGGTTTCATCR:CAGCTGCGATCATCCTCT75～24857174NM173894Bcl-2F:CTGCACCTGACGCCCTTCACR:GCGTCCCAGCCTCCGTTGT325～56064236NM001166486β-actinF:CTTCAACACCCCTGCCATR:CTCGGCTGTGGTGGTGAAG38～27560238JF830811

1.9 數據分析

采用SPSS21.0 統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析，分析不同COCs組卵母細胞中EGF、EGFR、Bax和Bcl-2 mRNA以及蛋白質的表達差異，成熟率以卵母細胞數為基數進行比較，每組至少3次重復。結果以“平均值±標準差(Mean±SE)”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結 果

2.1 FSH對牦牛卵母細胞成熟率的影響

根據卵丘細胞的擴散(圖1)和第一極體(圖2)來判斷卵母細胞的成熟情況，隨著卵母細胞的成熟，卵丘細胞擴散越明顯(圖1)，成熟卵母細胞的第一極體為圓形，胞質均質，膜表面平滑完整(圖2)。消化卵丘細胞后，根據成熟卵母細胞排出第一極體來統計卵母細胞的成熟率(表2)，發現成熟培養液中加入FSH均可提高COCs的成熟率，當成熟液中加FSH為5 μg·mL-1時成熟率最高，達到76.84%，其顯著高于其他組(P<0.05)； 2和 10 μg·mL-1FSH組成熟率分別為67.41% 和 57.23%；無FSH(0 μg·mL-1)陰性對照組的成熟率最低，為51.97%。10 μg·mL-1FSH組與無FSH(0 μg·mL-1)陰性對照組之間差異不顯著(P>0.05)，而其他組別之間均差異顯著(P<0.05)。

2.2 FSH對牦牛卵母細胞中EGF和EGFR mRNA水平的影響

通過實時熒光定量對EGF和EGFR的相對表達量進行分析表明(圖3)，在 0、2和5 μg·mL-1FSH組中，隨著FSH濃度增加，EGF和EGFR表達量逐漸升高；然而，在10 μg·mL-1FSH組中，EGF和EGFR的表達水平降低，其中在5 μg·mL-1FSH組中，EGF和EGFR的表達均顯著高于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)。

2.3 FSH對牦牛卵母細胞中Bax和Bcl-2 mRNA水平的調節

通過實時熒光定量對Bax和Bcl-2的相對表達量進行分析表明(圖4)，在2和5 μg·mL-1FSH組中，Bax和Bcl-2的表達顯示明顯的逆向模式，Bcl-2的表達水平逐漸升高，Bax的表達水平逐漸降低。5 μg·mL-1FSH組Bax的表達量最低，其顯著低于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)，而Bcl-2表達量最高，其顯著高于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)。2 μg·mL-1FSH組中Bax的表達水平低于0和10 μg·mL-1FSH組，Bcl-2在2 μg·mL-1FSH組中的表達均比0和10 μg·mL-1FSH組高。

A.未成熟的卵母細胞； B.陰性對照卵母細胞(FSH 0 μg·mL-1)；C.2 μg·mL-1 FSH；D.5 μg·mL-1 FSH；E.10 μg·mL-1 FSHA.Immature oocytes; B.The negative control oocytes (0 μg·mL-1 FSH); C. 2 μg·mL-1 FSH；D. 5 μg·mL-1 FSH；E. 10 μg·mL-1 FSH圖1 牦牛未成熟的卵母細胞和4種不同濃度FSH處理24 h后的成熟卵母細胞(200×,標尺50 μm)Fig.1 Development of yak oocytes in vitro with 4 different FSH concentrations for 24 h and immaturate oocytes (200×,Bar 50 μm)

A.成熟卵母細胞；B.未成熟卵母細胞。.第一極體A. Mature oocytes; B.Immature oocytes. .The first polarbody圖2 根據第一極體判斷卵母細胞的成熟(200×，標尺 50 μm)Fig.2 The maturation of oocytes were assessed based on first polar body (200×,Bar 50 μm)

表2不同濃度FSH對卵母細胞成熟率的影響

Table2RatesofmatureyakoocytesafteradditionofFSHwithvariousconcentrations

FSH濃度/(μg·mL-1)FSH concentration 卵母細胞數(重復次數)Number of oocytes (replicates)卵母細胞的成熟率/%Rate of mature yak oocytes061(3)51.97±4.83a276(3)67.41±2.16c542(3)76.84±5.32b1060(3)57.23±3.49a

同一列中不同字母表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05)

Different superscripts(a, b, c) indicate the significant difference among different concentration groups (P<0.05)

誤差線上不同的字母表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05);相同的字母表示不同濃度組間差異不顯著(P>0.05)。下同Bars with different superscripts mean significant difference among different concentration groups (P<0.05); Bars with same superscripts mean no significant difference among different concentration groups (P>0.05). The same as below圖3 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛卵母細胞EGF和EGFR的相對表達量Fig.3 Relative abundance of EGF and EGFR mRNA in yak oocytes with different concentrations of FSH

2.4 EGF和EGFR在牦牛COCs中的分布檢測

對EGF和EGFR蛋白分別用藍色和綠色進行熒光染色(圖5)。FSH濃度較低時，EGF和EGFR的熒光強度較低，卵丘細胞擴增不完整(圖5 A1，圖5 A2, 圖5 B1和圖5B2)隨著FSH濃度增加時，EGF和EGFR的熒光強度逐漸增強，其中5 μg·mL-1FSH組中EGF和EGFR表達水平最高，并且卵丘細胞的擴增比其他組的細胞擴增完整(圖5 C1和圖5 C2)，但當FSH濃度增加到10 μg·mL-1時，而熒光強度降低(圖5 D1，圖5 D2)。通過免疫熒光檢測發現，EGF主要位于卵丘細胞中，而EGFR在卵丘細胞和卵母細胞上均可檢測到(圖5)。

圖4 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛卵母細胞Bax和Bcl-2 的相對表達量Fig.4 Relative abundance of Bax and Bcl-2 mRNA in yak oocytes with different concentrations of FSH

圖5 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛COCs中EGF、EGFR蛋白分布(200×)Fig.5 The distribution of EGF and EGFR proteins in yak COCs with different concentrations of FSH(200×)

2.5 FSH對牦牛卵母細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

Western blotting方法檢測,添加FSH顯著增加了牦牛COCs中抗凋亡分子Bcl-2蛋白水平的表達，同時也明顯降低了牦牛COCs中促凋亡分子Bax蛋白水平的表達(10 μg·mol-1FSH組除外)(圖6A)。在5 μg·mL-1FSH組中Bax表達量最低，其顯著低于0 (陰性對照)、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)，而在10 μg·mL-1FSH組中Bax表達量最高(圖6B)；Bcl-2蛋白在5與10 μg·mL-1FSH組中相比其表達量接近，其差異性不顯著(P>0.05)(圖6B)。

圖6 Western blotting檢測(A)及不同組Bax和Bcl-2蛋白水平的表達(B)Fig.6 Detected the expression levels (B) of Bax and Bcl-2 proteins by Western blotting(A) in different groups

3 討 論

了解生殖激素對成熟卵母細胞的調節作用對于開發有效的體外成熟(IVM)體系是非常重要的。本研究探討了FSH對牦牛卵母細胞IVM的特異性作用及其對EGF、EGFR、Bax和Bcl-2等生長和凋亡相關因子的作用。EGFR的特異性抑制劑tyrphostin AG 1478有效阻斷FSH誘導的豬卵母細胞減數分裂的恢復，表明EGFR或EGF受體信號通路與FSH的作用有關[20]。此外，EGF和FSH對豬卵母細胞細胞質的成熟具有協同作用[21]。本研究發現，FSH提高了牦牛COCs中細胞核的成熟率(表2)，并且在體外條件下，誘導了牦牛卵母細胞成熟過程中EGF和EGFR的表達(圖3和圖5)，而且其與FSH的濃度有關；當FSH為5 μg·mL-1時，卵母細胞中EGF和EGFR水平最高，卵母細胞成熟率最高，卵丘細胞的擴增比其他各組均完整(圖1和圖5)，但當FSH為10 μg·mL-1時，卵母細胞成熟率及EGF、EGFR、Bcl-2表達均下降(表2，圖6)，而Bax增強(圖4和6)。因此，本研究發現牦牛卵母細胞體外成熟過程中FSH的最適濃度為5 μg·mL-1。

本研究結果表明，FSH誘導牦牛卵丘細胞的擴張(圖1和圖5)。前人研究表明，FSH在卵母細胞發育中起關鍵作用[22]，其可以增強卵丘細胞的擴張[23]，這與本研究相一致；EGF和EGFR在牦牛卵母細胞成熟過程中受FSH的誘導表達，并且牦牛卵丘細胞的增殖與其表達水平一致。FSH主要通過激活cAMP依賴性信號通路后激活其周圍卵丘細胞中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)[24]，卵泡發生～早期竇性階段被認為FSH是獨立的，而竇性(晚期)卵泡發生完全依賴FSH[25]，但是，cAMP不能直接激活MAPK[26]，cAMP激活MAPK的具體過程尚未完全了解。FSH通過p38 MAPK誘導信號轉導和轉錄激活因子1(STAT1)絲氨酸727去磷酸化作用可以下調細胞色素P450 1B1(cytochrome P450 B1, Cyp1b1)表達并維持小鼠優勢卵泡中的雌二醇水平[27]，FSH和17β-雌二醇聯合作用時，通過cAMP、Ca2+內流和ERK1/2途徑參與了FSH和17β-雌二醇對細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA和細胞周期蛋白E1(Cyclin E1)mRNA在細胞中的表達[28]。蛋白激酶A II(protein kinase A II, PKAII)和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是FSH通過MAPK激活而起作用的可能途徑[29]。綜上，EGF和EGFR在FSH誘導的牦牛卵母細胞發育過程中發揮重要作用。然而，在大多數組中EGFR的表達水平高于EGF(圖3)，這可能是由許多激活EGFR配體引起的，包括EGF、TGFα、雙調蛋白(Ar)、肝素結合的EGF(HB-EGF)和鈣結合蛋白-D9k(CaBP-9k)等[30-31]。因此，FSH對COCs分泌EGFR配體的影響不容忽視，本研究用熒光標記物標記的EGF和EGFR在牦牛COCs中具有特異性的表達，其在卵丘細胞和卵母細胞上均可檢測到EGFR，而EGF僅在卵丘細胞上檢測到(圖5)，這與卵丘細胞的存在對于EGF作用是必需的[21]研究相一致。

卵母細胞質量是決定胚胎發育的最重要參數，結合COCs的形態學研究凋亡基因的表達是判斷COCs質量的重要標準。本研究在卵丘細胞完全擴張組中Bcl-2基因表達量最高，而Bax表達最低，同時卵母細胞的成熟率也最高，這表明FSH通過調控Bax、Bcl-2等凋亡相關基因的表達，抑制了卵母細胞凋亡。有研究表明，Bax和Bcl-2表達與體外培養的牛卵母細胞和胚胎質量有關[18]，Bax與Bcl-2的比率可以用來測量卵母細胞和胚胎存活或凋亡的趨勢。然而，調控卵母細胞質量并影響卵母細胞和胚胎發育的細胞凋亡基因很多[32]，FSH在哺乳動物卵母細胞成熟和胚胎發育過程中是否誘導其他凋亡基因尚不清楚。

本研究FSH誘導EGF、EGFR和Bcl-2表達趨勢在牦牛卵母細胞發育過程是一致的，而Bax的表達恰恰與其相反。Kawamura等[33]研究表明，EGF作為自分泌/旁分泌的生長因子可促進人早期胚胎發育，EGF對凋亡相關基因是可以進行調控的[34]。本研究結果表明，在牦牛卵母細胞成熟過程中，FSH可調節EGF、EGFR、Bcl-2和Bax的表達。因此，推測EGF、EGFR、Bcl-2和Bax在FSH誘導的卵母細胞成熟和抑制細胞凋亡中起重要作用，但Bax和Bcl-2變化是否受FSH誘導的EGF和EGFR調節，以及FSH信號傳導通路與EGF、EGFR、Bax和Bcl-2的關系有待進一步研究。

4 結 論

在牦牛卵母細胞體外成熟過程中，FSH提高卵母細胞發育能力并誘導EGF和EGFR表達，而且通過調控Bax、Bcl-2等凋亡相關因子的表達，抑制卵母細胞凋亡，推測EGF、EGFR、Bcl-2和Bax在FSH誘導卵母細胞成熟和抑制細胞凋亡中起重要作用，為進一步探討FSH在牦牛生殖過程中發揮的作用以及EGF和EGFR對牦牛卵母細胞成熟和后期胚胎發育的影響提供理論依據。