廣東?、裥网喴呃锸蠗U菌分離鑒定及PFGE分型研究

郭晶瑩，李亞菲，蔣紅霞，曾振靈*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)/國家獸藥安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣州 510640)

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)引起的急性、敗血性、接觸性的傳染病，呈急性或敗血癥感染，主要引起各種炎癥，如纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎及關(guān)節(jié)炎等[1-2]。發(fā)病沒有季節(jié)性，多見于秋冬季節(jié)及潮濕天氣[3]。潛伏期較短，一般為2～5 d，最長為一周，可感染2～8周齡的雛鴨、雛鵝、火雞等，尤其以2～3周齡的雛鴨最易感染。該病可在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，最早發(fā)現(xiàn)于歐洲國家；隨后在前蘇聯(lián)、印度等國家都有發(fā)現(xiàn)[4-6]；2004年，日本、韓國等東亞國家對(duì)其有所報(bào)道，亞洲已經(jīng)成為鴨疫里氏桿菌病流行的主要地區(qū)[7-8]。自1982年在我國北京周邊地區(qū)發(fā)現(xiàn)鴨疫里氏桿菌病以來，浙江、山東、廣西等各個(gè)省、市、自治區(qū)都有該病的報(bào)道[9-11]，已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)鴨行業(yè)的發(fā)展，是造成水禽養(yǎng)殖行業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一。

利用血清型對(duì)鴨疫里氏桿菌進(jìn)行分型是早年間常用的方法之一。目前已報(bào)道的鴨疫里氏桿菌血清型有25種，其中1～21型為國際上早已報(bào)道的血清型，22～25型為我國程安春等[12]在進(jìn)行血清型調(diào)查時(shí)新發(fā)現(xiàn)的血清型。由于鴨疫里氏桿菌血清型眾多，各個(gè)血清型之間無明顯交叉保護(hù)現(xiàn)象[13]，且不同地區(qū)不同年間鴨疫里氏桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，這給疾病的治療帶來了巨大的困難。除了傳統(tǒng)的血清型分型方法外，多種分型方法也可用于鴨疫里氏桿菌分子分型[14]，如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA， RAPD)技術(shù)、細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR(repetitive-element PCR，rep-PCR)技術(shù)及單鏈多態(tài)性(single strand conformation polymorphism， SSCP)技術(shù)等，其中脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)技術(shù)被稱為調(diào)查細(xì)菌分子流行病學(xué)相關(guān)性及溯源的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15]，具有重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，已被運(yùn)用于不同種屬細(xì)菌的分子分型[16-18]。本實(shí)驗(yàn)室近年來已運(yùn)用PFGE技術(shù)對(duì)鴨疫里氏桿菌菌株間遺傳關(guān)系進(jìn)行了初步研究，Sun等[19]、張亞楠等[20]已對(duì)廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌部分菌株成功分型。為掌握廣東地區(qū)Ⅰ型血清型鴨疫里氏桿菌菌株流行情況，分析菌株間遺傳關(guān)系，本研究對(duì)2007至2017年間廣東地區(qū)分離的220株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行Ⅰ型血清型鑒定，并對(duì)血清Ⅰ型菌株進(jìn)行SmaⅠ-PFGE分子分型。旨在調(diào)查近年來廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌優(yōu)勢(shì)血清型，并應(yīng)用SmaⅠ-PFGE分子分型技術(shù)對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型菌株之間進(jìn)行遺傳關(guān)系的研究，不但為本地區(qū)鴨疫里氏桿菌滅活疫苗的研制及臨床治療提供一定的指導(dǎo)，還從分子水平確定菌株同源性，進(jìn)而確定傳染源和流行范圍。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病料樣本 2007—2017年在廣東省廣州、清遠(yuǎn)、佛山、惠州、江門等地采集疑似傳染性漿膜炎特征性癥狀的病死鴨、鵝的腦或肝組織，分離并鑒定得到鴨疫里氏桿菌220株。其中，在鵝源病料樣本中分離得到86株菌，在鴨源病料樣本中分離得到134株菌。2007—2013年和2013—2015年分離的35株和95株鴨疫里氏桿菌菌株分別為本實(shí)驗(yàn)室前期Sun等[19]和張亞楠等[20]分離。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母提取粉(yeast extract)購自英國OXOID公司；新生牛血清購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；rTaq DNA聚合酶、DL2000、dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

其他試劑：氯化鈉、冰醋酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、甲醛均購自廣州化學(xué)試劑廠；SmaⅠ內(nèi)切酶、10×T buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖(MegaBase瓊脂糖)、PFGE瓊脂糖購自美BIO-RAD公司；蛋白酶K、溶菌酶均購自美國Sigma公司。十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tris堿(Tris-base)、乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)均購自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司。

血清Ⅰ型鴨疫里氏桿菌參考菌株RA1由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)，分型血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理教研室以參考菌株免疫家兔制得。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～2.5 kg雄性新西蘭兔，購自南方醫(yī)科大學(xué)。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株 沙門菌H9812作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離鑒定 用滅菌的無菌棉簽蘸取病死鴨或鵝的腦、肝等組織，劃線接種于含有0.5% 酵母提取粉和5%新生牛血清的TSA平板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中(5%～10%CO2，37 ℃條件下)培養(yǎng)24 h。挑取TSA平板上呈圓形、微突起、表面光滑、奶油狀、直徑1～2 mm的菌落接種于3 mL含有0.5%酵母提取粉和5%新生牛血清的TSB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后進(jìn)行純化培養(yǎng)和鑒定，采用美國德靈公司Micro Scan Walk Away-40全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定疑似菌株。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[19]，合成鴨疫里氏桿菌外膜蛋白引物序列，PCR鑒定引物序列分別如下，RA-F：5′-CTTGGTATCCAAGGGGATTAATGTTT-3′，RA-R：5′-TTTAACTGAGATGGGTTACCAACTTC-3′，目的基因長度為707 bp。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，送北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 凝集抗血清的制備 按文獻(xiàn)[5]報(bào)道方法，將Ⅰ型血清型菌株RA1蘸取少許用3 mL TSB肉湯溶解，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，用接種環(huán)在TSA平板上劃線，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)一步純化，將培養(yǎng)在TSA平板上的菌群用FPSS(0.3% formalinised physiological saline solution，即加入3%甲醛的生理鹽水)溶液洗滌，離心兩次后，將菌體以FPSS懸浮，調(diào)節(jié)OD值(optical density)至0.2(525 nm)，作為制備抗血清的抗原。

將抗血清抗原經(jīng)耳緣靜脈多次注射雄性健康新西蘭兔，每4 d注射一次，劑量分別如下：0.05、0.1、0.2、0.5、0.5、1.0、1.0、1.5、2.0 mL，最后1次注射抗原后7 d，進(jìn)行心臟采血，制備血清。將收集到的血液室溫下靜置2 h，離心10 min，收集上清，獲得血清。

1.2.3 血清型鑒定 玻板凝集試驗(yàn)，取干凈載玻片一張，滴加陽性血清少許，用粗接種環(huán)蘸取待檢菌的純培養(yǎng)物，將載玻片輕輕晃動(dòng)或用接種環(huán)涂開，在幾秒內(nèi)出現(xiàn)明顯白色絮狀凝集塊者，判定為陽性結(jié)果。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳 在仲崇岳[21]建立的快速脈沖場凝膠電泳技術(shù)和本試驗(yàn)前期研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)，參照標(biāo)準(zhǔn)化PFGE流程進(jìn)行。

1.2.4.1 模塊的制備：將凍干保存的鴨疫里氏桿菌及沙門菌H9812復(fù)蘇，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，用接種環(huán)在TSA平板上劃線，置于37 ℃含5% CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，將具有典型形態(tài)的菌落涂布于TSA平板上，過夜培養(yǎng)后，用一次性接種環(huán)刮取適量菌體于1 mL STE溶液(0.01 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.001 mol·L-1Na2EDTA，pH8.0；0.4%NaCl)中，重懸，使用分光光度計(jì)調(diào)整OD600nm值至2.0左右，取100 μL細(xì)菌混懸液至1.5 mL Eppendorf 管中，加入10 μL溶菌酶(20 mg·mL-1)和90 μL 1.2%STE溶解的低熔點(diǎn)瓊脂糖，充分混勻后注入一端封口的模具中，4 ℃放置5～10 min使模塊凝固。

1.2.4.2 細(xì)菌原位裂解：小心取出模具的模塊后，轉(zhuǎn)入含有3 mL lysis buffer(含有2 mg·mL-1溶菌酶的STE)溶液，于42 ℃水浴2 h。棄去lysis buffer，加入5 mL CLP溶液(cell lysis/proteinase K Buffer，即0.05 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.05 mol·L-1Na2EDTA，pH8.0；1%十二烷基肌胺酸鈉；1% SDS；0.2 mg·mL-1蛋白酶K)，55 ℃水浴3 h。

1.2.4.3 模塊洗滌：小心取出模塊，加入8～10 mL預(yù)熱至50 ℃的滅菌雙蒸水，于50 ℃水浴輕微振蕩20 min，重復(fù)兩次。然后用8～10 mL預(yù)熱至50 ℃的TE緩沖液液(0.01 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.001 mol·L-1Na2EDTA，pH8.0)于50 ℃緩慢振蕩洗滌20 min，重復(fù)兩次。洗滌完畢后，在室溫下于TE溶液中緩慢冷卻。

1.2.4.4 限制性內(nèi)切酶消化：切下2 mm寬洗滌后的膠塊，依次加入145 μL的滅菌雙蒸水、25 μL的BSA、25 μL的10×T buffer、3.5 μL的SmaⅠ(5 U·μL-1)，于30 ℃水浴酶切3～4 h。剩下的膠塊置于TE溶液中于4 ℃保存。

1.2.4.5 制備PFGE瓊脂糖凝膠：按照1.0%的比例，用0.5×TBE電泳緩沖液制備PFGE凝膠。將酶切處理后的膠塊置于梳齒位置，然后用低熔點(diǎn)瓊脂糖對(duì)點(diǎn)樣端封口，于冰板上靜置待其凝固。

1.2.4.6 電泳：加入約2.5 L 0.5×TBE電泳緩沖液于CHEF-DR?III System(Bio-Rad Laboratories，USA)電泳槽中，依次打開電源開關(guān)-循環(huán)泵開關(guān)-冷卻系統(tǒng)I/O開關(guān)。脈沖場凝膠電泳參數(shù)設(shè)置如下：起始緩沖時(shí)間2.16 s，結(jié)束緩沖時(shí)間54.17 s，電泳時(shí)間20 h，電壓6 V·cm-1，溫度14 ℃，角度120 °，斜率:線性。待電泳緩沖液冷卻到14 ℃時(shí)開始電泳。

1.2.4.7 染色與拍照：電泳結(jié)束后，將電泳膠塊放入濃度為1 μg·mL-1的EB溶液中，染色30 min以上，然后用雙蒸水漂洗凝膠塊20 min后，放入凝膠成像系統(tǒng)，照像拍照，保存圖像并記錄結(jié)果。用BioNumerics(Version6.0 Applied Math，Inc)軟件處理并分析PFGE分型圖譜，比較鴨疫里氏桿菌DNA條帶同源性，條帶解釋參考Tenover等[22]的報(bào)道。

2 結(jié) 果

2.1 鴨疫里氏桿菌的分離鑒定

在2007—2017年分離得到的220株鴨疫里氏桿菌中，130株菌株由本實(shí)驗(yàn)室前期Sun等[19]和張亞楠等[20]分離鑒定。因此，需將從2015年9月至2017年6月在廣東廣州、清遠(yuǎn)、佛山、惠州、江門五個(gè)城市采集的病料樣品中分離的90株菌株進(jìn)行16S RNA鑒定。提取菌株DNA作為模板，采用已發(fā)表的外膜蛋白基因OmpA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果如圖1所示。將鑒定擴(kuò)增結(jié)果送北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，NCBI進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示這90株菌株均為鴨疫里氏桿菌，其中，77株鴨疫里氏桿菌菌株為鵝源，13株鴨疫里氏桿菌

菌株為鴨源，對(duì)確定為鴨疫里氏桿菌的菌株編號(hào)命名，采用“菌株種屬+編號(hào)+來源+時(shí)間”的方式進(jìn)行命名，以RAGD211QYGoose2015為例，其為一株編號(hào)為211的鵝源鴨疫里氏桿菌，在2015年清遠(yuǎn)分離得到。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.樣品PCR產(chǎn)物；P.陽性擴(kuò)增結(jié)果M. DL2000 marker；1-3. PCR products；P. Positive result圖1 鴨疫里氏桿菌OmpA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of OmpA gene

2.2 血清型鑒定

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的220株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行Ⅰ型血清型鑒定，其中，Ⅰ型血清型共119株，占總分離株54.09%，非Ⅰ型血清型為101株，占總分離株的45.91%。Ⅰ型血清型為2007—2017年間廣東地區(qū)的主要流行血清型。不同年代間菌株分布結(jié)果、各個(gè)地區(qū)菌株分布結(jié)果、不同來源菌株分布結(jié)果分別見表1～3。

表1各年份Ⅰ型血清型菌株比例

Table1ProportionoftypeⅠserotypeR.anatipestiferisolatesindifferentperiod

年份Year鴨疫里氏桿菌菌株數(shù)Number of R. anatipestifer isolatesⅠ型血清型菌株數(shù)Number of serotypeⅠstrains比例/%Proportion2007.05—2013.01351851.432013.02—2015.07955456.842015.09—2016.06281760.712016.07—2017.06623048.392007.01—2017.0622011954.09

表2各地區(qū)Ⅰ型血清型菌株比例

Table2ProportionoftypeⅠserotypeR.anatipestiferisolatesineachplace

來源地Origin鴨疫里氏桿菌菌株數(shù)Number of R. anatipestifer isolatesⅠ型血清型菌株數(shù)Number of serotypeⅠ strains比例/%Proportion清遠(yuǎn)1155144.35廣州553054.55江門44100.00惠州6466.67佛山312580.65云浮11100.00東莞11100.00肇慶100.00汕尾6350.00廣東22011954.09

表3各來源Ⅰ型血清型菌株比例

Table3ProportionoftypeⅠserotypeR.anatipestiferisolatesineachsource

來源Source鴨疫里氏桿菌菌株數(shù)Number of R. anatipestifer isolatesⅠ型血清型菌株數(shù)Number of serotypeⅠ strains比例/%Proportion鴨源1347052.24鵝源864956.98

2.3 優(yōu)勢(shì)血清型SmaⅠ-PFGE分型

119株Ⅰ型血清型鴨疫里氏桿菌進(jìn)行SmaⅠ-PFGE分型，有110株成功分型。部分代表性菌株的SmaⅠ-PFGE分型圖譜如圖2所示。使用BioNumerics6.0聚類軟件進(jìn)行分析，110株鴨疫里氏桿菌的相似度為19.98%～100%，以相似度≥85%進(jìn)行歸類，共得到33種不同的類型，可分為19個(gè)簇和14個(gè)單一型。在這19個(gè)簇中，Cluster F和Cluster S為優(yōu)勢(shì)簇，都含有12個(gè)菌株，除優(yōu)勢(shì)簇以外，Cluster C、J、M、N、P中各有2個(gè)菌株；Cluster A、E、Q、R中各有3個(gè)菌株；Cluster D、K、L中各有6個(gè)菌株；Cluster G、H中各有8個(gè)菌株；Cluster B、I、O中分別含有4、5、7個(gè)菌株。除了圖2中各個(gè)簇代表菌株，其余每簇所包含具體菌株信息如表4所示。結(jié)果表明Ⅰ型鴨疫里氏桿菌分子型別呈現(xiàn)多樣化，不同的菌株之間的同源性差異較高，但存在小范圍的克隆傳播。

3 討 論

鴨疫里氏桿菌血清型眾多，各血清型之間交叉免疫保護(hù)弱，這給鴨疫里氏桿菌病的防控帶來了巨大的困難，因此，掌握我國各個(gè)地方的鴨疫里氏桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型，對(duì)于該地流行病學(xué)的調(diào)查、疫病的防控和疫苗株的選擇具有重要的意義。廣東省地處南方，天氣潮濕，極易導(dǎo)致該病的發(fā)生，同時(shí)又是水禽養(yǎng)殖的大省，一旦發(fā)病，將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)研究了2007—2017年廣東地區(qū)近十年來分離的220株鴨疫里氏桿菌Ⅰ型血清型的流行特點(diǎn)，研究時(shí)間跨度長，涉及地方較多，為廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌病的滅活疫苗的研制及使用提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

目前，對(duì)廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌優(yōu)勢(shì)血清型的報(bào)道雖然不少，但是研究涉及的菌株量較少，且時(shí)間跨度短。吳彩艷等[23]對(duì)2006—2008年廣東地區(qū)86株鴨疫里氏桿菌血清型鑒定結(jié)果表明有81株為Ⅰ型血清型，Ⅰ型血清型為廣東優(yōu)勢(shì)血清型。魏秀麗等[24]對(duì)廣東地區(qū)20株鴨疫里氏桿菌的血清型鑒定結(jié)果顯示有15株為10型，但僅有3株為Ⅰ型。張濟(jì)培等[25]對(duì)珠三角地區(qū)100株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)有83株為Ⅰ型血清型。而本研究對(duì)近十年來廣東省220株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行了血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型血清型菌株占總分離株的54.09%，雖然不同年間Ⅰ型血清型所占比例各不相同，但總體而言Ⅰ型血清型仍然是優(yōu)勢(shì)血清型。與之前該地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型流行情況相比，本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果與其基本保持一致，即：呈現(xiàn)出以Ⅰ型血清型為主要流行血清型，其他血清型同時(shí)存在的流行趨勢(shì)。將本試驗(yàn)結(jié)果與吳彩燕等[23]、張濟(jì)培等[25]所報(bào)道的廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌Ⅰ型血清型所占比例進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本研究得到的Ⅰ型血清型菌株所占比例嚴(yán)重下降，但與魏秀麗等[24]報(bào)道的對(duì)比，Ⅰ型血清型菌株所占比例明顯升高，這可能與不同實(shí)驗(yàn)室分離的菌株來源不同有關(guān)，同時(shí)也與之前張大丙和郭玉璞[5]、程安春等[12]報(bào)道的鴨疫里氏桿菌血清型流行情況基本相符：即使是同一地方，不同時(shí)間內(nèi)，鴨疫里氏桿菌主要流行血清型也會(huì)隨著時(shí)間的改變而改變。

圖2 鴨疫里氏桿菌分離株P(guān)FGE代表性圖譜Fig.2 PFGE fingerprinting patterns of SmaⅠ-digested total DNA patterns from representative R. anatipestifer isolates

研究也發(fā)現(xiàn)，即使是在同一時(shí)間同一地區(qū)，不同鴨場的優(yōu)勢(shì)血清型不盡相同。例如同為2015年在廣州采集到的病料，增城區(qū)分得的鴨疫里氏桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為Ⅰ型，花都區(qū)分得的則非Ⅰ型，這可能是不同養(yǎng)殖場引進(jìn)的種鴨或種鵝不同。同一鴨場不同時(shí)間也會(huì)存在不同的血清型，如同為在廣東佛山三水一個(gè)養(yǎng)殖場采集到的鵝源病料，RAGD204FSGoose2015、RAGD205FSGoose2015、RAGD206FSGoose、RAGD318FSGoose2016為Ⅰ型血清型，而RAGD313FSGoose2016為非Ⅰ型，推測(cè)此鵝場可能引進(jìn)新的雛鵝或在繁殖過程中發(fā)生血清型變化。

對(duì)鴨疫里氏桿菌分子學(xué)分型的方法有很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)[14]。Kiss等[26]首次運(yùn)用PFGE技術(shù)和Eric-PCR技術(shù)對(duì)鴨疫里氏桿菌進(jìn)行菌株間親緣鑒定，兩者分型的結(jié)果具有相似性，故認(rèn)為兩種方法都可以作為分子分型的方法。仲崇岳[21]運(yùn)用快速脈沖場凝膠電泳技術(shù)對(duì)四川地區(qū)70多株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行分型得到了60種表型(以相似度80%為標(biāo)準(zhǔn))。本研究室近年來對(duì)鴨疫里氏桿菌PFGE分型的方法進(jìn)行研究，Sun等[19]對(duì)68株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行PFGE分型，有43株成功分型，并以85%的相似度作為標(biāo)準(zhǔn)將其分成了13種表型。張亞楠等[20]對(duì)廣東地區(qū)115株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行SmaⅠ-PFGE分型，僅有58株分型成功，推測(cè)鴨疫里氏桿菌血清型可能會(huì)對(duì)脈沖場凝膠電泳產(chǎn)生影響。因此，本研究對(duì)Ⅰ型血清型鴨疫里氏桿菌進(jìn)行了PFGE分型。根據(jù)之前的研究，對(duì)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，增加了溶菌酶的含量以及裂解時(shí)間，使得菌體得到充分的裂解。119株Ⅰ型血清型鴨疫里氏桿菌中共有110株成功分型。但仍有9株未成功分型，這可能與菌株自身有關(guān)，也可能與PFGE實(shí)驗(yàn)操作過程中某些參數(shù)設(shè)置有關(guān)，因此需要進(jìn)一步的研究與優(yōu)化。

通過SmaⅠ酶對(duì)鴨疫里氏桿菌基因組不同位點(diǎn)進(jìn)行酶切，并運(yùn)用PFGE分型技術(shù)將同一血清型的菌株根據(jù)相似度≥85%分成不同的條帶型別，110株菌可得到33種不同的表型。同一血清型經(jīng)PFGE分型后得到不同表型說明PFGE分型法比血清學(xué)分型法分辨力更高。這33種不同的SmaⅠ-PFGE表型可分為19個(gè)簇和14個(gè)單一型。在這19個(gè)簇中，不同簇所含菌株數(shù)量不相同，優(yōu)勢(shì)簇Cluster F和S含有較多菌株(12株)，而其他簇所含菌株量都較少，如僅含有2個(gè)菌株的Cluster C、J、M、N、P；含有3個(gè)菌株的Cluster A、E、Q、R等。另外不同簇之間相似度相差很大，例如，Cluster D和Cluster E之間相似度為84%，而Cluster E與Cluster S之間相似度僅為19%。

根據(jù)PFGE分型圖譜發(fā)現(xiàn)，即使是同一養(yǎng)殖場Ⅰ型血清型的鴨疫里氏桿菌，也存在多樣化的遺傳背景，例如：RAGD201GZGoose2015和RAGD203GZGoose2015的SmaⅠ-PFGE遺傳圖譜同屬于Cluster F，它們之間的相似度達(dá)到了99%，而與RAGD202GZGoose2015相比則相差甚遠(yuǎn)。鴨疫里氏桿菌在局部地區(qū)不僅具有多樣化的遺傳背景，同時(shí)還存在克隆傳播。以優(yōu)勢(shì)簇Cluster F為例，RAGD201GZGoose2015、RAGD103GZDuck2010、RAGD147QYGoose2015及RAGDFSDuck2015，是分別來自廣州、清遠(yuǎn)、佛山不同時(shí)間、不同來源的優(yōu)勢(shì)簇菌株，從PFGE關(guān)系圖譜來看他們是屬于同一進(jìn)化群的，具有相似度很高的SmaⅠ-PFGE遺傳圖譜。此外還發(fā)現(xiàn)，同一進(jìn)化群的鴨疫里氏桿菌對(duì)雛鴨、雛鵝的侵害是不分種屬的，既可在種屬之內(nèi)、之間相互感染，也可在種屬之間相互感染。

本文對(duì)2007—2017年廣東地區(qū)分離的鴨里氏桿菌Ⅰ型血清型進(jìn)行調(diào)查和鑒定，并運(yùn)用脈沖場凝膠電泳技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子分型，不僅從宏觀的角度上為該地區(qū)鴨疫里氏桿菌病的疫苗的研發(fā)及使用提供參考指導(dǎo)，使得疾病的發(fā)生和治療有了相應(yīng)的依據(jù)。還在分子層次上將PFGE技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)測(cè)所得的菌株，建立了近年來廣東地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型鴨疫里氏桿菌遺傳圖譜，揭示了優(yōu)勢(shì)血清型鴨疫里氏桿菌的遺傳多態(tài)性及傳播特性，有助于實(shí)現(xiàn)該菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)和傳染源溯源，對(duì)控制鴨疫里氏桿菌引起的動(dòng)物源性疾病的流行有著重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)廣東地區(qū)220株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行Ⅰ型血清型鑒定，并對(duì)血清Ⅰ型菌株進(jìn)行SmaⅠ-PFGE分子分型，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型血清型為近年來廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型，且Ⅰ型血清型菌株之間分子型別呈現(xiàn)多樣化，同源性差異較高，但存在小范圍內(nèi)的克隆傳播。