郁金散對大腸濕熱證大鼠血清免疫球蛋白與抗氧化相關因子的調節作用

張亞輝，姚萬玲，文艷巧，華永麗，紀 鵬，魏彥明

(甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070)

大腸濕熱證系指濕熱蘊結大腸，下焦氣機壅滯，致使大腸傳導失職，所表現出來的一系列以泄瀉下痢為主的證候。在獸醫臨床中常見多發，給畜牧業經濟造成一定損失。郁金散為治療大腸濕熱證的經典中獸藥方劑，具有澀腸止瀉、利濕導滯、清熱解毒、調血行氣、止痛等功效[1]。

有研究表明，濕熱證本質與機體免疫、氧化與抗氧化等功能密切相關[2]。濕熱證是內外濕邪共同作用引起的急性外感熱病，濕熱病邪侵犯機體與正氣相爭，出現“濕阻”“熱蘊”的病理變化，這與現代醫學中病原微生物感染引起機體免疫功能紊亂的機制相似[3]。濕熱證的外感病邪與病毒、細菌等的感染有直接關系，病原微生物感染則會引起機體氧化應激現象[4]。機體抗氧化系統與免疫系統密不可分，免疫細胞處于氧化與抗氧化平衡中維持細胞正常功能。大腸濕熱證會使機體處于氧化應激狀態，過量ROS會阻滯Ca2+內流，導致淋巴細胞不能正常進行有絲分裂，最終導致淋巴細胞出現凋亡；同時過量ROS氧化血清白蛋白，進而誘導自身抗體合成[5]，從而加劇免疫功能的紊亂。

本課題組以前的研究表明：郁金散可通過抗腹瀉、抗炎、降血脂、緩解血瘀、修復腸黏膜以及調節和保護多臟器等多方面的綜合作用治療大腸濕熱證[6]，另外可通過調控機體胃腸激素水平而調節胃腸道運動功能[7]。因此，本研究在此基礎上，通過各組大鼠血清免疫球蛋白的檢測及相關免疫器官的系統觀察，以及分析血清及肝抗氧化因子的變化，以從體液免疫、抗氧化功能等方面闡明郁金散對大腸濕熱證的治療作用機制，為開發治療大腸濕熱證型腹瀉藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠)，酶標儀(美國BIO-RAD公司)，切片機(Leica公司)，OlympusDP-71顯微照相系統，白酒(北京紅星二鍋頭，56°)，IgA、IgG、IgM、一氧化氮(NO)、脂質過氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)。

1.2 大腸桿菌懸液制備

菌種為產毒性大腸桿菌O101，購于中國獸醫藥品監察所，菌號CVCC231。菌株保存在-80 ℃條件下備用。臨用前室溫下解凍，接種至營養肉湯中37 ℃培養18 h，然后接種于營養瓊脂培養基培養24 h，挑取單菌落于營養肉湯中37 ℃振蕩培養至所需濃度，置4 ℃下保存備用。

1.3 郁金散制備

根據《中獸醫學》配方組成[1]：郁金30 g、白芍15 g、黃芩30 g、訶子15 g、黃柏30 g、黃連30 g、大黃60 g、梔子30 g，進行郁金散制備：按比例稱取藥物于10倍水中浸泡30 min，武火煮沸后改用文火煎煮30 min，4層紗布過濾；藥渣再以6倍水重復煎煮30 min；合并兩次濾液，減壓濃縮，定容至1.04 g·mL-1，置4 ℃下保存備用。依據《中國獸藥典》計算大鼠臨床等效給藥劑量為0.52 g·mL-1，設置郁金散高、中、低劑量分別為10.4、5.2、2.6 g·kg-1。以上中藥均購自甘肅西域陽光大藥房，經甘肅農業大學魏彥明教授鑒定。

1.4 動物分組及造模

60只體重180～220 g的Wistar大鼠，清潔級，雌雄各半，購于蘭州大學醫學院實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK(甘)2013-0002。自然環境，常規飼養，適應環境1周后，隨機分6組，每組10只：分別為正常對照組、模型組、自愈組、郁金散高、中、低劑量組。按照實驗室建立的方法[6-7]進行大腸濕熱證模型復制，分3個階段，(1)高糖高脂階段：模型組，自愈組，郁金散高、中、低劑量組大鼠造模全程自由飲用300 g·L-1蜂蜜水，單日禁食，雙日飼喂充足飼料并灌服豬油2 mL·100 g-1，共10 d；(2)高溫高濕階段：除對照組大鼠，其余大鼠每天灌喂56°白酒(北京紅星二鍋頭)1 mL·100 g-1，置于高溫倉(溫度31～35 ℃，相對濕度93%±2%)8 h·d-1，共5 d；(3)攻毒階段：經高溫高濕階段的大鼠腹腔注射濃度為1.69×109CFU·mL-1的產毒性大腸桿菌菌液0.2 mL·100 g-1，24 h后，再以0.1 mL·100 g-1的劑量注射一次，自然環境飼養1 d，模型建立成功。造模完成后，處死模型組大鼠取樣。郁金散高、中、低劑量組分別以10.4、5.2、2.6 g·(kg·d)-1劑量灌胃方藥，共5 d；自愈組灌服等量生理鹽水。試驗期間，正常對照組處于自然環境，喂普通飼料，灌胃、腹腔注射等量生理鹽水。試驗結束后處死所有大鼠取樣。

1.5 樣本采集

大鼠處死前禁食12 h，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進行麻醉(30 mg·kg-1)，腹主動脈采血收集于真空采血管中，室溫靜置2～4 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。采血完畢，迅速剖取脾、胸腺，用生理鹽水洗凈，放入10%的福爾馬林(即4%甲醛)溶液中固定，用來制作病理切片。迅速剖取肝，用預冷生理鹽水洗凈，稱取0.5 g左右，加生理鹽水1∶9進行勻漿，4 ℃ 3 500 r·min-1離心15 min，再以2 500 r·min-1離心10 min，分別吸取上清液，-20 ℃保存備用。

1.6 血清免疫球蛋白的檢測

按ELISA試劑盒說明書方法檢測各組血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平。

1.7 病理組織切片觀察

將脾和胸腺組織用10%福爾馬林溶液固定15 d， 漂洗組織中的固定液，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋，切片(4 μm)，常規HE染色，用顯微照相系統觀察并采集照片。

1.8 血清及肝抗氧化指標的檢測

按ELISA試劑盒說明書方法檢測血清及肝組織勻漿上清液LPO、MDA、GSH、NO水平。

1.9 數據統計

2 結 果

2.1 血清免疫球蛋白含量變化

由圖1可知：與正常對照組相比，模型組中IgA、IgM和IgG含量極顯著升高(P<0.01)；自愈組中IgA含量顯著升高(P<0.05)，IgM和IgG含量極顯著升高(P<0.01)。與自愈組相比，郁金散高劑量組中IgA和IgM的含量顯著降低(P<0.05)，IgG含量極顯著降低(P<0.01)；郁金散中劑量組中IgM含量顯著降低(P<0.05)，IgA和IgG的含量降低，但差異不顯著(P>0.05)。結果表明，大腸濕熱證模型大鼠血清IgA、IgM和IgG含量升高，郁金散治療后其含量下降，其中高劑量治療效果最好。

標有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖1 血清中IgA、IgM和IgG的含量變化Fig.1 Change of content of IgA,IgM and IgG in serum

2.2 脾組織學觀察

顯微鏡下觀察，正常對照組，脾紅、白髓分界清楚，組織形態正常，動脈周圍淋巴鞘無異常變化，而紅髓中可見含鐵血黃素的巨噬細胞，表明脾免疫功能正常(圖2A、a)。大腸濕熱證模型組，紅、白髓界限模糊，白髓比例上升；紅細胞數目增多，沒有含鐵血黃素的巨噬細胞；白髓中淋巴細胞數目減少，可見壞死的淋巴細胞；紅髓中有大量淋巴細胞彌漫性增生和浸潤(圖2B、b)。治療組白髓與紅髓分界比較清楚；未見含鐵血黃素的巨噬細胞，但形態正常；動脈周圍淋巴鞘的形態較正常組變化不明顯，而淋巴細胞數目相較于正常對照組少(圖2C、c)。

2.3 胸腺組織學觀察

顯微鏡觀察發現，正常對照組，皮質區淋巴細胞密集(圖3a)，髓質區淋巴細胞稀松(圖3A)，形態完整，結構正常。大腸濕熱證模型組，未被脂肪代替的胸腺組織，皮質、髓質交界模糊，淋巴細胞數量減少，小葉內皮質網狀細胞增生，胸腺小體數量減少，小血管充血，皮質部被脂肪代替的胸腺組織，可以看到有大量的脂肪細胞(圖3B、b)。郁金散高劑量治療組，皮質區淋巴細胞密集，被膜較厚(圖3C)，髓質區淋巴細胞少而稀疏，形態完整，結構趨于正常(圖3c)。

2.4 血清中抗氧化指標檢測

由圖4可知：與正常對照組相比，模型組MDA、LPO含量極顯著升高(P<0.01)，GSH和NO含量極顯著降低(P<0.01)；自愈組MDA含量顯著升高(P<0.05)，LPO含量極顯著升高(P<0.01)，GSH和NO含量顯著降低(P<0.05)。與自愈組相比，高劑量組MDA顯著降低(P<0.05)，LPO含量極顯著降低(P<0.01)，GSH和NO含量顯著升高(P<0.05)；中劑量組LPO含量極顯著降低(P<0.01)，MDA的含量降低，但差異不顯著(P>0.05)，GSH和NO含量升高，但差異不顯著(P>0.05)；低劑量組LPO含量極顯著降低(P<0.01)，MDA含量降低但差異不顯著(P>0.05)，GSH和NO含量升高但差異不顯著(P>0.05)。說明郁金散能夠降低大腸濕熱證機體血清中的MDA和LPO，升高血清中GSH和NO，且高劑量郁金散的效果最好。

A、a.正常對照組；B、b.大腸濕熱證模型組；C、c.郁金散高劑量治療組。箭頭表示白髓；三角箭頭表示紅髓A, a. Normal control group; B, b. LIDHS model group; C, c.High dose of Yujin Powder groups. The arrows indicate white pulps; The triangular arrow indicate red pulps圖2 脾病理組織學觀察(HE染色)Fig.2 Spleen histopathological observation (HE staining)

A、a.正常對照組；B、b.大腸濕熱證模型組；C、c.郁金散高劑量治療組。五角星代表髓質；三角形表示皮質；箭頭指充血血管；三角箭頭指脂肪細胞A, a. Normal control group; B, b. LIDHS model group; C, c.High dose of Yujin Powder groups. The pentagram represents the medulla and the triangle represents the cortex； Arrows indicate vascular congestion； The triangular arrow refers to fat cells圖3 胸腺病理組織學觀察(HE染色)Fig.3 Thymus histopathological observation (HE staining)

標有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖4 血清中MDA、GSH、LPO、NO的含量Fig.4 Content of MDA, GSH, LPO, NO in serum

2.5 肝組織中抗氧化指標檢測

由圖5可知：與正常對照組相比，模型組中MDA和LPO含量極顯著升高(P<0.01)，NO含量極顯著降低(P<0.01)，GSH含量極顯著降低(P<0.01)；自愈組MDA含量極顯著升高(P<0.01)，LPO含量顯著升高(P<0.05)，NO和GSH含量顯著降低(P<0.05)。與自愈組相比，高劑量組MDA含量極顯著降低(P<0.01)，LPO顯著降低(P<0.05)，NO極顯著升高(P<0.01)，GSH顯著升高(P<0.05)；中劑量組LPO含量顯著降低(P<0.05)，NO和GSH含量顯著升高(P<0.05)；低劑量組MDA、LPO、NO和GSH均差異不顯著。說明郁金散能升高大腸濕熱證大鼠肝中的NO和GSH含量，降低MDA和LPO含量，且高劑量效果最好。

3 討 論

3.1 郁金散對大腸濕熱證大鼠血清免疫球蛋白及免疫器官的調節

本研究中發現大腸濕熱證大鼠血清IgM、IgA和IgG的含量顯著升高，提示免疫系統功能變化在濕熱證轉化轉歸中起重要作用。中醫辨證屬濕熱證的患者存在著免疫功能異常現象[8]。陳江華等[9]對濕熱證患者體液免疫狀況的臨床研究發現，濕熱證患者血清IgA、IgM、IgG、C3水平較正常人顯著升高。白愛平等[10]、佟麗等[11]研究發現，濕熱證機體免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、C3、C4補體水平顯著升高。這與本研究結果一致。體液免疫增強，可能與濕熱證為多種急性熱病，機體對致病微生物等的急性炎癥反應，免疫系統對病原微生物的錯誤識別引起的自身免疫反應[12]等有關。經郁金散治療后，濕熱證大鼠IgM、IgA和IgG含量顯著降低。說明郁金散可以有效緩解大腸濕熱證引起的體液免疫亢進，從而調節機體免疫功能。

標有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 肝中MDA、GSH、LPO、NO的含量Fig.5 Content of MDA, GSH, LPO, NO in liver

脾是免疫應答、進而產生抗體分泌細胞的關鍵免疫器官，其形態結構的變化可反映免疫應答調節的狀態[13]。胸腺是中樞免疫器官，T、B細胞發育的重要場所之一[14]。本研究大腸濕熱證模型組大鼠脾和胸腺組織結構出現紊亂，脾白髓與紅髓界限模糊，淋巴細胞數目減少，可見壞死的淋巴細胞。胸腺組織皮質、髓質交界模糊，淋巴細胞數量減少，胸腺小體數量減少。這些結果表明大腸濕熱證可引起大鼠脾和胸腺組織結構紊亂，淋巴細胞的異常凋亡，從而導致機體免疫功能異常。郁金散高劑量組，脾紅、白髓交界較為清晰，淋巴細胞數目增多，但低于正常組；胸腺皮質區淋巴細胞密集，被膜較厚。提示經郁金散治療后，各器官形態結構趨于正常。這些結果表明郁金散可有效緩解大腸濕熱證引起的免疫器官的功能異常。

郁金散影響機體免疫功能的可能原因：郁金散組方中君藥郁金對體液免疫具有抑制作用[15]。臣藥中黃連可抑制免疫細胞凋亡，減輕免疫器官萎縮[16]；黃芩化學成分黃芩苷、黃芩素具有免疫調節作用；黃柏能夠抑制小鼠遲發型超敏反應，從而抑制細胞免疫，減輕炎癥損傷[17]。佐藥中大黃可顯著提高免疫低下小鼠淋巴細胞的增殖能力[18]；白芍總苷具有多途徑抑制自身免疫反應的作用[19]；訶子同樣具有免疫調節作用[20]。因此，郁金散可通過降低大腸濕熱證機體血液中免疫球蛋白的含量，調節體液免疫，同時通過調節免疫器官功能達到治療大腸濕熱證的目的。

3.2 郁金散對大腸濕熱證大鼠抗氧化相關因子的調節

本研究結果顯示，大腸濕熱證大鼠血清和肝中MDA和LPO的含量顯著性升高，GSH和NO含量下降。徐萌等[21]研究發現，濕熱證動物模型由于病原微生物的刺激而發生不同程度的氧化應激，致使機體LPO和MDA水平升高。佟麗等[11]、張霓[22]研究表明濕熱證大鼠模型MDA含量上升。這與本研究結果一致。MDA是脂質過氧化的最終產物，其水平可反應組織過氧化損傷的程度；LPO濃度的改變可直接反應機體脂質過氧化的強度。本研究MDA、LPO含量增高，提示濕熱證機體脂質過氧化強度過高，出現明顯的過氧化損傷。劉德傳等[23]研究表明，濕熱證模型大鼠GSH-Px活性明顯降低，NO含量顯著下降，這與本試驗結果相符。GSH可清除體內自由基和ROS，防止肝細胞損傷[24]。NO是一種重要的非酶抗氧化劑，正常水平會起到清除氧自由基的作用，且NO在高溫損傷過程中發揮重要的調節作用[25-26]。GSH水平降低提示機體自由基清除障礙，抗氧化能力減弱，NO含量降低則加劇高溫損傷。對中醫濕熱證證候的應用研究表明，濕熱證患者和模型動物機體氧化反應增強，抗氧化功能減弱，細胞膜完整性受損，引起壞死，從而導致大量病理產物堆積[27]，這是濕熱證形成的關鍵。因此，大腸濕熱證模型大鼠機體中存在嚴重的氧化和抗氧化系統失衡。

經郁金散治療后，MDA、LPO、GSH和NO的含量均明顯回調，且郁金散高劑量組效果最明顯，各指標含量趨于正常。藥理研究表明，郁金散組方中黃連、黃柏、梔子具有清除自由基、脂質過氧化的作用[17, 28-29]；黃芩可減少自由基產生及體內脂質過氧化，增強細胞膜的保護作用[30]；白芍的活性成分五沒食子酰基葡萄糖有抗氧化活性[31]；訶子提取物可顯著增加模型鼠體內GSH的含量，降低LPO的含量[32]；大黃中的大黃酚可增強抗氧化酶的活性，減少過氧化脂質[33]。表明郁金散具有調節機體氧化和抗氧化功能，增強清除自由基的能力，減輕機體過氧化損傷，提高機體免疫力，從而起到治療大腸濕熱證的作用。

4 結 論

大腸濕熱證機體存在免疫功能異常和氧化/抗氧化失衡現象，郁金散可通過調控大腸濕熱證機體的免疫功能和抗氧化/氧化平衡而治療大腸濕熱證。為研究郁金散治療大腸證的機制以及開發治療濕熱證疾病的藥物奠定了理論基礎。