小鼠大腦中動(dòng)脈近端及遠(yuǎn)端阻塞腦缺模型比較

孔德蓮，管樟萌，祖 潔，秦敬翠，馬海玲，陸 燕，何 清*

（1．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬市立醫(yī)院，江蘇 徐州 221001；2．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221001）

人類的缺血性腦卒中是一種具有復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制的異質(zhì)性疾病，所以想要在一個(gè)動(dòng)物模型中模仿人類腦卒中的各個(gè)方面是不可行的。目前大部分卒中人群的梗死區(qū)主要在大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）供血區(qū)內(nèi)，所以大部分卒中模型選擇阻斷MCA或者它的一個(gè)分支。傳統(tǒng)的MCAO模型是利用線栓阻塞大腦中動(dòng)脈近端制作的腦缺血模型，簡(jiǎn)稱線栓MCAO。但該方法對(duì)術(shù)者技術(shù)要求高，模型制作難度較大，腦損傷體積大，動(dòng)物不易長(zhǎng)期存活，不利于對(duì)腦缺血的長(zhǎng)期研究。大腦中動(dòng)脈永久性閉塞（p-MCAO）模型采取電凝阻斷小鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈血流方法實(shí)現(xiàn)同側(cè)相應(yīng)供血區(qū)皮層發(fā)生缺血性損傷，即所謂的“凝血模型”，該模型尚未像線栓法MCAO模型那樣在各實(shí)驗(yàn)室普及。本研究通過(guò)比較p-MCAO模型與傳統(tǒng)的MCAO模型在模型制作成功率、模型制作成功后的死亡率、腦梗死體積、神經(jīng)行為學(xué)等方面的差異，探討兩種MCAO模型的優(yōu)劣性和應(yīng)用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組及模型制作

野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)并繁殖于徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所，飼養(yǎng)條件保持室溫22～25℃，予以12 h光照，12 h黑暗。采用隨機(jī)數(shù)表方法將48只雄性（8-12周，SPF級(jí)）野生型小鼠隨機(jī)分為3組：①P-MCAO組（n=18）；②線栓組（n=18）；③對(duì)照組（n=12）。

2 遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型（Permanent MCAO Model，P-MCAO）制作過(guò)程

見圖1[1]。具體步驟為：（1）小鼠用小動(dòng)物吸入麻醉系統(tǒng)，異氟烷麻醉（2）小鼠右側(cè)臥位于手術(shù)臺(tái)上，應(yīng)用脫毛劑（8%硫化鈉）將左側(cè)眼部至耳部的毛發(fā)脫凈，解剖顯微鏡下在消毒后的區(qū)域切開1 cm的切口。（3）分離皮膚并定位顳肌，掀開肌肉。（4）在透明的顱骨下找到“Y”型大腦中動(dòng)脈分支的近端及遠(yuǎn)端動(dòng)脈分叉。（5）用骨鉆在血管分叉處打磨顱骨直至顱骨變得薄薄的一層，用精細(xì)鑷小心地將動(dòng)脈上方的顱骨掀開。正確分辨出MCA的分支，分別距離分叉處1 mm電凝三支動(dòng)脈血管。（6）縫合傷口。

圖1 P-MCAO模型示意圖[2]

2.1 線栓組傳統(tǒng)的MCAO模型制作[3,4]

手術(shù)分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾暫時(shí)關(guān)閉頸總動(dòng)脈，由頸外動(dòng)脈注入栓子后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎，開放頸總動(dòng)脈，使栓子自頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入MCA而建立MCAO模型。

2.2 對(duì)照組

正常飼養(yǎng)，未予任何手術(shù)處理。

2.3 小鼠腦缺血模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)

按照參考文獻(xiàn)[5]評(píng)定，在造模后18 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)價(jià)：0級(jí)=無(wú)缺陷； l級(jí)=對(duì)側(cè)前肢不能伸展；2級(jí)=對(duì)側(cè)前肢屈曲； 3級(jí)=輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級(jí)=嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級(jí)=對(duì)側(cè)癱瘓。

2.4 TTC染色測(cè)定腦梗死體積[6]

分別取各組術(shù)后（或者假手術(shù)后）24小時(shí)的小鼠，取腦，制作冰凍切片，將切片置于TTC染液中，用錫箔紙蓋住后（避光），放入37℃保溫箱中15～30 min。將數(shù)碼相機(jī)固定于腦片垂直上方30 cm處拍照。正常腦組織中線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶與TTC反應(yīng)呈鮮紅色，梗死區(qū)由于缺少線粒體而不著色。拍照后利用Image Pro Plus 6.0軟件分別測(cè)出梗死側(cè)非梗死區(qū)的面積和對(duì)側(cè)半球的面積。兩者之差即為腦梗死面積，再除以對(duì)側(cè)半球面積，即為相對(duì)腦梗死面積比，依次得出5個(gè)相對(duì)腦梗死面積比，乘以2 mm即為相對(duì)腦梗死體積比[8]。

2.5 大鼠神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)比較

模型建立后，進(jìn)行兩項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)比較，包括上提肢體搖擺實(shí)驗(yàn)（elevated body swing test，EBST）[7]和圓柱筒實(shí)驗(yàn)[8,9]。行為學(xué)檢測(cè)采用雙盲法。術(shù)前24小時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，只有行為學(xué)表現(xiàn)符合要求的才可入組并繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后24 h再次進(jìn)行行為學(xué)測(cè)驗(yàn)。

2.5.1 EBST

主要用于評(píng)價(jià)小鼠的肢體翻轉(zhuǎn)功能及前肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性。術(shù)后24小時(shí)，觀察者提起小鼠尾巴根部，距離地面約10 cm，記錄小鼠向左右搖擺的次數(shù)，搖擺角度需＞10度，＜10度則不計(jì)入總數(shù)，20次為限。該方法主要用來(lái)觀察小鼠肢體運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性。計(jì)算小鼠左右搖擺的比例并加以統(tǒng)計(jì)。

2.5.2 圓柱筒試驗(yàn)

正式實(shí)驗(yàn)前3天內(nèi)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次行為學(xué)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)情緒過(guò)于緊張/躍出筒內(nèi)者，或者10 min內(nèi)貼壁次數(shù)小于5次者，不參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別在術(shù)前1天、術(shù)后1天用攝像機(jī)記錄，每次記錄10分鐘，每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄2次，2次的時(shí)間間隔至少為30分鐘。應(yīng)用視頻軟件慢放的功能，分別計(jì)數(shù)每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)左前肢觸壁（L），右前肢觸壁（R）及雙側(cè)前肢同時(shí)觸壁（D）次數(shù)，最終取每一小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的兩次計(jì)數(shù)的均值帶入公式計(jì)算：行為學(xué)得分/score=（R+D/2）/（R+L=D）×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，分別進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 腦卒中小鼠24 h存活率、腦梗死體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果

（1）建模后24 h內(nèi)，P-MCAO組死亡1只，余17只繼續(xù)進(jìn)行行為學(xué)觀察。線栓法組死亡5只，余13只繼續(xù)行為學(xué)觀察。線栓組死亡率＞p-MCAO組。對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。（2）TTC染后，p-MCAO組和線栓組，均清晰可見腦梗死區(qū)域（白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域） ，但梗死區(qū)域在線栓組明顯大于p-MCAO組（圖2）。兩組腦梗死體積比較較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1，圖2。

3.2 腦卒中行為學(xué)觀測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

①EBST實(shí)驗(yàn)：p-MCAO組、線栓組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；p-MCAO組與線栓組比較，無(wú)顯著差異（表2）。

圖2 線栓組（A）和p-MCAO組（B）腦缺血模型TTC染色結(jié)果

②玻璃圓筒貼壁實(shí)驗(yàn)：p-MCAO組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；線栓組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；p-MCAO組與線栓組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組相對(duì)腦梗死體積結(jié)果（ ±s）

表1 兩組相對(duì)腦梗死體積結(jié)果（ ±s）

注：兩組相對(duì)腦梗死體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

分組（group） 相對(duì)腦梗死體積（%）線栓組（n=17） 57.35±5.12 P-MCAO組（n=13） 32.87±3.79

表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估（ ±s）

表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估（ ±s）

注：與對(duì)照組比較，1P＜0.05；與線栓組比較，2P＜0.05

組別/行為學(xué)評(píng)分上提肢體搖擺試驗(yàn)評(píng)分（%）圓柱筒試驗(yàn)評(píng)分（%）對(duì)照組 20.11±3.32 0.27±0.10線栓組 0.00±0.001 42.23±0.021 P-MCAO組 12.11±0.021，2 15.92±2.171，2

4 討 論

腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重地影響人類的生存質(zhì)量。目前我國(guó)腦血管疾病占人群死亡病因的第二位。因此，模擬人類缺血性腦血管病的發(fā)病過(guò)程，建立重復(fù)性好、觀測(cè)指標(biāo)易于控制的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ鸵恢笔侨藗兤毡殛P(guān)注的課題。因此，在過(guò)去的幾十年中，本著研究腦缺血的機(jī)制以及尋找更有效的治療藥物，研究者們開發(fā)了許多腦缺血的動(dòng)物模型。

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ桶床课环譃榫衷钚阅X缺血模型和全腦缺血模型；臨床上，缺血性腦血管病多為局灶性，以大腦中動(dòng)脈（middle cerebral anery，MCA）及其分支閉塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）多見，約占腦梗死的70%。因此，制作MCA缺血并且可實(shí)現(xiàn)再灌注的動(dòng)物模型更接近臨床。MCA模型被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｆ渲校娔ㄔ?981年由Tamura等首先建立，并經(jīng)Bederson，Osborne、Shigeno等進(jìn)一步改良，2014年由Llovera[10,11]等改良后建立了電凝經(jīng)顱永久性遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞模型（P-MCAO），本模型的優(yōu)勢(shì)在于造模的死亡率低，重復(fù)性好。同時(shí)梗死區(qū)主要在皮層，梗死面積的大小與大部分卒中患者的梗死體積具有一致性[11]。線栓塞法是手術(shù)分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾暫時(shí)關(guān)閉頸總動(dòng)脈，由頸外動(dòng)脈注入栓子后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎，開放頸總動(dòng)脈，使栓子自頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入MCA而建立MCAO模型。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TTC染色后對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠進(jìn)行梗死面積分析，獲得直接測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)，兩種不同造模方法所造成的腦梗死體積明顯不同。線栓法MCAO梗死區(qū)域主要局限于一側(cè)半球皮質(zhì)區(qū)和紋狀體（圖2A），p-MCAO組梗死區(qū)域主要局限于一側(cè)皮質(zhì)區(qū)（圖2B），且兩者之間梗死體積的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明MCA損傷段不同，產(chǎn)生的腦梗死體積也不同。線栓法腦缺血模型主要阻塞MCA起始段，同時(shí)影響CCA，ICA的部分灌注，所以產(chǎn)生的梗死區(qū)域較大，影響也比較廣泛。而p-MCAO法直接電凝MCA遠(yuǎn)端，對(duì)CCA，ICA等無(wú)影響，所以梗死區(qū)域局限于MCA遠(yuǎn)端供血區(qū)，對(duì)大鼠的神經(jīng)功能影響也較局限。

行為學(xué)研究在神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)功能研究中占有舉足輕重的地位，本實(shí)驗(yàn)中小鼠的兩種不同的缺血模型對(duì)神經(jīng)功能的影響是不同的，且不同的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)神經(jīng)功能的評(píng)定的側(cè)重點(diǎn)也是不同的。通過(guò)EBST，圓柱筒試驗(yàn)兩種行為學(xué)功能的檢測(cè)比較，表面在腦卒中幾星期p-MCAO會(huì)對(duì)小鼠造成一定的神經(jīng)功能的損傷，但不及線栓法腦缺血模型對(duì)小鼠造成的神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重。

綜上，p-MCAO由于對(duì)MCA的損傷位于遠(yuǎn)端，造成的腦梗死面積較小，腦梗死局限于大腦皮質(zhì)前側(cè)面及少量皮質(zhì)下腦組織，模型制作完成后小鼠存活時(shí)間較長(zhǎng)，適合涉及為期較長(zhǎng)的行為學(xué)測(cè)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)。許多研究，像對(duì)藥物的評(píng)價(jià)研究，干細(xì)胞治療后的長(zhǎng)期療效研究等等，需要長(zhǎng)期觀察才能得出結(jié)論，應(yīng)用此模型較為合適。而線栓法腦缺血模型對(duì)動(dòng)物損傷大，模型制作完成后小鼠存活時(shí)間較短，適宜短期的腦缺血后的行為學(xué)及生理/病理/機(jī)制等的研究。