鹽脅迫下陸地棉耐鹽相關WRKY基因的表達分析

蔡繼鴻，徐 鵬，張香桂，郭 琪，徐珍珍，沈新蓮

(1.南京農業大學，江蘇南京210095;2.江蘇省農業科學院經濟作物研究所/農業部長江下游棉花油菜重點實驗室，江蘇南京210014)

為適應不良生長環境，植物在長期的進化過程中形成了一系列復雜而有效的應對機制。現有的研究表明，這種由于自身進化而獲得的應對機制主要是通過轉錄激活或轉錄抑制相關基因的表達發生作用的。而在這一過程中，轉錄因子發揮重要作用，通過與其他相關蛋白或自身之間的相互作用激活或抑制相關靶基因的表達。近年來，研究顯示WRKY轉錄因子家族中眾多成員都參與植物的非生物脅迫響應機制［1］，目前已經成為植物抗性功能研究中的一個熱點。

WRKY轉錄因子作為一個重要的轉錄因子超家族，除了參與植物的生長發育、物質代謝途徑及在抗病毒、細菌等方面發揮重要的調節作用外，還參與應答環境信號刺激，如低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫逆境［2］。近年來，由于鹽堿化對我國農業的影響，植物耐鹽機制的研究已成為熱點。目前很多研究都表明WRKY參與植物對鹽脅迫的響應。在前期的研究中，基于鹽脅迫下旱地棉轉錄組測序，共鑒定了28個受鹽脅迫誘導的WRKY基因［3］。本研究對耐鹽陸地棉品種K368和鹽敏感品種蘇棉12號的28個耐鹽相關WRKY基因進行表達分析，為棉花耐鹽機制的研究提供有力的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為陸地棉品種K368和蘇棉12號(簡稱:蘇12)。將種子播于盆缽中，待長至2葉1心時開始鹽處理，將小苗浸在含 200 mmol/L NaCl(其中 Na+∶Ca2+濃度比為15 ∶1)的營養液中，分別處理 0、6、24、72 h，取不同時期的根液氮速凍后于－70℃保存備用。

1.2 耐鹽鑒定

耐鹽鑒定試驗于2006年12月在江蘇省農業科學院經濟作物研究所培養室進行。將預發芽的K368和蘇12種子播于土質盆砵中，將盆砵放于28℃光照培養箱中培養，待長至2葉1心時開始鹽處理，鹽處理濃度為350 mmol/L。處理當天取10株幼苗作為對照，測定相關指標，包括植株高度、地上部生長量等。處理7 d后測定鹽脅迫下和清水對照的10株植株相關指標，計算植株相對高度、地上部相對生長量等。性狀相對值為脅迫環境下某性狀表型值與對照環境下某性狀表型值的比率，計算公式:某性狀相對值=某一性狀鹽脅迫時表型值/對照環境表型值。

1.3 實時熒光定量PCR

不同鹽處理時期根樣RNA提取參照文獻［4］。以反轉錄獲得的cDNA為實時熒光定量PCR的模板，以棉花的Actin作為內參基因，根據WRKY基因的非保守區設計特異性引物，對WRKY基因進行熒光定量PCR擴增，檢測基因受鹽脅迫誘導時的表達情況。實時熒光定量PCR分析方法參照文獻［3］，數據分析通過 2－ΔΔCT公式計算基因的相對表達量［5］。

1.4 數據統計

采用Excel 2010進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下K368和蘇12表型比較

由圖1可知，與對照相比，經350 mmol/L鹽處理7 d后，K368和蘇12均出現明顯的鹽害脅迫癥狀，生長均受到明顯抑制。與K368相比，蘇12在生長上受到的抑制更明顯。鹽處理7 d后測定相關指標來評價2個品種的耐鹽性，包括植株相對高度、相對地上部鮮質量和相對地上部干質量等。由表1可知，K368和蘇12相對株高、相對地上部鮮質量、相對地上部干質量差異極顯著。因此，認為K368相對于蘇12表現出更好的耐鹽性。

2.2 鹽脅迫下耐鹽相關WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12根部的表達分析

表1 鹽脅迫下K368和蘇棉12號表型比較

利用實時熒光定量PCR對耐鹽品種K368的28個耐鹽相關WRKY基因進行表達分析，由圖2可知，較之對照(鹽處理0 h)，27個WRKY基因在鹽處理不同時期(6、24、72 h)誘導表達中僅WRKY22表達差異不顯著。大部分耐鹽相關WRKY基因隨著鹽處理時間延長，其相對表達量表現為逐步上升的趨勢，且大部分WRKY基因在鹽處理24 h后其相對表達量達到最高，其中WRKY5、WRKY6以及WRKY38在鹽處理24 h后其相對表達量上調300倍以上;僅WRKY107隨著鹽處理時間延長，其相對表達量表現為逐步下調趨勢。

本研究同樣對鹽敏感品種蘇12的28個WRKY基因進行了表達分析，由圖3可知，25個WRKY基因鹽脅迫誘導表達中僅WRKY9、WRKY75、WRKY105表達差異不顯著。大部分WRKY基因鹽脅迫后其相對表達量表現為上調表達，其中WRKY31在鹽處理24 h后上調表達800倍以上;僅WRKY22、WRKY52、WRKY90鹽處理后表現為下調表達。

2.3 耐鹽相關WRKY基因在K368和蘇12中差異表達分析

本研究分別對28個WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12中進行了差異表達分析，其中22個WRKY基因在品種間表達趨勢表現一致，即鹽處理后WRKY基因在K368和蘇12較之對照均表現為上調表達或下調表達，僅僅在表達量上存在差異。其中12個WRKY基因在耐鹽品種K368中相對表達量更高，如WRKY6在耐鹽品種K368中鹽處理24 h后其相對表達量達到了300倍以上，在鹽敏感品種蘇12中，其相對表達量在鹽處理72 h后最高，與對照相比較，其表達量僅上調了6倍。5個WRKY基因在鹽敏感品種蘇12中相對表達量更高，如WRKY43在蘇12中其相對表達量在鹽處理24 h達到約600倍，而在耐鹽品種K368中，其相對表達量在鹽處理24 h后僅上調了不到10倍。5個WRKY基因在K368和蘇12中表達量相當，無明顯差異。此外，有6個WRKY基因在K368和蘇12中表達不一致，WRKY52、WRKY90鹽處理后在K368中表現為上調表達，而在蘇12中則表現為下調表達;WRKY9、WRKY75、WRKY105鹽處理后在K368中表現為上調表達，而在蘇12中差異表達不顯著;WRKY22鹽處理后在蘇12中表現下調表達，而在K368中差異表達不顯著。綜上所述，鹽脅迫后總共有23個WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12中差異表達，僅 WRKY5、WRKY27、WRKY28、WRKY51 及WRKY104無明顯差異。推測該23個WRKY基因可能與陸地棉耐鹽性有一定的關聯。

3 討論與結論

許多研究已報道了WRKY基因可能參與鹽脅迫誘導表達，在植物中過量表達一些WRKY基因能夠改良植物的耐鹽能力。在擬南芥中，35個WRKY基因中有18個基因被鹽脅迫誘導表達，過量表達WRKY25、WRKY33可明顯提高擬南芥的耐鹽性［6］。Qiu等研究發現，水稻的13個WRKY基因中有9個應答NaCl處理，過量表達OsWRKY45可提高擬南芥的耐鹽性［7］。大豆中64個WRKY轉錄因子中的22個在鹽脅迫下差異表達，過量表達大豆GmWRKY54可提高擬南芥的耐鹽性［8］。過量表達玉米ZmWRKY33可改善擬南芥的耐鹽性［9］。這些都說明WRKY轉錄因子家族成員是響應鹽脅迫反應的重要調控因子。本研究在前期研究的基礎上繼續對受鹽脅迫誘導的28個WRKY基因在陸地棉中進行表達分析，大部分WRKY基因均表現為不同程度的誘導表達，推測可能與陸地棉耐鹽特性有一定關聯性，但是表達強度的差異是否影響到基因功能，對此還需要進一步研究。

目前，棉花中已經有很多關于WRKY響應鹽脅迫反應報道。Shi等從陸地棉中分離出GhWRKY39，該基因被病原菌以及鹽脅迫誘導，在擬南芥中過量表達該基因能夠提高其耐鹽性［10］。Zhou等從陸地棉中鑒定了26個WRKY基因，在NaCl誘導下其中的5個基因在根中上調表達［11］。Cai等在全基因組范圍內分析雷蒙德氏棉WRKY基因家族，同時也在陸地棉中分析了這些基因在非生物脅迫下的表達情況［12－13］。所有這些結果表明WRKY基因參與了棉花對鹽脅迫網絡調控的應答。