硫酸軟骨素二糖對疲勞致小鼠腎臟炎癥的改善作用

劉 芳,曹婉秀,李兆杰,薛長湖,唐慶娟

(中國海洋大學食品科學與工程學院,人類健康實驗室,山東青島 266003)

腎臟是機體排泄的主要場所,也是維持機體內環境的主要器官。具有調節機體水鹽平衡、調節血壓以及排出機體代謝廢物等功能,與機體的工作能力有著密切的聯系。當腎臟功能失調時,機體代謝異常,身體的毒素無法及時的排除,長時間的堆積會引發一系列的身體病變。因此,保護腎臟極其重要。然而,隨著經濟的發展,人們的工作強度隨之加大。研究發現,工作強度過大會對腎臟造成嚴重的氧化損傷[1]。此時,組織會產生大量的氧自由基并發生氧化應激。自由基的大量積累可激活NF-κB等,激活腎臟細胞中IL-6、MCP-1等[2]炎癥因子的表達。IL-6、MCP-1等炎癥因子過表達會引起腎小管損傷,甚至導致組織壞死。因此,尋找具有抗氧化、有效緩解腎臟炎癥、保護腎臟作用的功效因子迫在眉睫。

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)是一類聚合的多糖化合物,由重復的葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)二糖單位組成,是一類存在于人和動物軟骨、結締組織中的具有特殊生物活性的酸性黏多糖。美國食品藥品監督管理局(FDA)認定硫酸軟骨素為緩解關節炎的膳食補充劑,在歐洲已經將硫酸軟骨素作為處方藥或非處方藥使用。在國內也將其載入了2010版《中國藥典》。近年來,硫酸軟骨素被證實具有抗氧化[3]、有抗炎[4-5]、抗過敏[6]等多種生物學功效,被廣泛應用于化妝品、功能食品、食品添加劑和醫藥領域中。作為一類聚合的多糖化合物,硫酸軟骨素多糖在小腸中難以吸收,主要通過結腸中腸道菌群的酵解作用[7]降解為二糖的形式再利用,即硫酸軟骨素二糖。有研究顯示,硫酸軟骨素的酶解產物二糖比硫酸軟骨素更容易被機體吸收利用且發揮更有效的生理活性[8-9]。目前,大量研究致力于對硫酸軟骨素二糖制備方法的優化及體外抗氧化活性的探討。然而將分離的硫酸軟骨素二糖用于抗腎臟炎癥的研究尚未見報道。

因此,本文采用雞軟骨來源的硫酸軟骨素二糖,利用小鼠疲勞應激模型,探討其對疲勞誘導的腎臟炎癥的改善作用,這將對開發具有保護腎臟功效作用的食品活性因子具有重要的指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸軟骨素二糖(81.21%的二糖的硫酸基團位于N-乙酰半乳糖胺中的C4位置,即CS-4S) 青島貝爾特生物科技有限公司;C57BL/6J小鼠 健康、雄性SPF級,體重19～20 g,4周齡,許可證號:SCXK(京)2007-0001,購自北京維通利華技術有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒 批號20150430、20150250,南京建成科技有限公司;TRIZOL試劑 美國Invitrogen公司;M-MLV逆轉錄酶 美國Promega公司;2×PCR mix 批號20160608101-2,北京博邁德科技發展有限公司;FastStart Univeral SYBR Green Master(Rox) 美國Roche公司;引物 上海生工生物工程有限公司;β-Actin-HRP抗體美國Santa Cruz Biotechnology公司;兔抗小鼠NF-κB、MCP-1、IL-6多克隆抗體 百靈威科技有限公司;羊抗兔IgG-HRP、MCP-1和IL-6抗體 北京博奧森生物科技有限公司;蛋白質裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(編號P0012)上海碧云天生物技術研究所;脫脂奶粉 美國BD公司。

YLS-10B型電動輪跑步機 山東醫學科學院提供;Nanodrop 2000/2000C型分光光度計 美國Thermo Scientific公司;iQ5型熒光定量PCR儀、Model 680型酶標儀 美國伯樂Bio-rad公司;Mastercycler personal PCR儀 德國Eppendorf AG公司;24D型垂直電泳槽和脫色搖床 北京六一儀器廠;SⅡ型半干轉膜儀 大連競邁生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預 24只實驗小鼠于動物培養中心適應飼養一周后,根據體重隨機分成正常組(N組)、疲勞應激組(M組)、正常小鼠灌胃硫酸軟骨素二糖組(CS組)、疲勞應激小鼠灌胃硫酸軟骨素二糖組(S組)。小鼠飼養在專門動物飼養籠內,室溫20～25 ℃,12/12 h光/暗周期,標準飼料喂養,自由飲用蒸餾水。將M和S組小鼠分別置于電動輪跑步機上,持續運動3 h(速度:20 r/min),持續2 d后恢復5 d。實驗周期為16 d,共運動6 d。N和CS組保持正常生活狀態。實驗期間S組和CS組每天灌胃150 mg/kg·bw硫酸軟骨素二糖,N組和M組每天灌胃等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。第17 d將小鼠摘眼球取血,脫頸椎處死取腎臟。

1.2.2 腎臟組織中SOD活力和MDA含量的測定 將小鼠腎臟組織從-80 ℃冰箱中取出,用RIPA裂解液冰浴勻漿。4 ℃勻漿30 min后,于12000 r/min、4 ℃離心5 min,取上清液。將樣品稀釋50倍后,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。后續操作參考SOD和MDA檢測試劑盒說明書。

1.2.3 Real-time PCR方法檢測炎癥相關基因的表達 將腎組織按照每0.1 g組織加1 mL TRIZOL的比例,4 ℃下勻漿后將勻漿液倒入1.5 mL滅酶離心管中,每管加入200 μL氯仿后，室溫靜置10 min。4 ℃ 12000 r/min離心15 min,將上清液轉移到1.5 mL離心管中,加入與上清液等體積的異丙醇,室溫靜置10 min。在4 ℃下12000 r/min離心10 min,用75%乙醇清洗后得到沉淀。加適量DEPC水(用焦碳酸二乙酯處理后，并經高溫高壓滅菌的MiliQ純水),溶解沉淀。取10 μL 1200 ng/μL RNA加入滅酶PCR小管中,加2 μL隨機引物、5 μL 5×M-MLV buffer、dNTP 0.5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、M-MLV逆轉錄酶1 μL和DEPC水4.5 μL。進行反轉錄,反應程序為:30 ℃,10 min;37 ℃,60 min;90 ℃,5 min;4 ℃ forever。反應結束后即得cDNA樣品。然后進行RT-PCR反應,25 μL反應體系為SYBR Green 12.5 μL,上、下游引物各0.75 μL,樣品cDNA 2.5 μL,超純水8.5 μL。反應條件為:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s,60 ℃,20 s,95 ℃,15 s(45個循環);65 ℃升溫至95 ℃(0.5 ℃/10 s)。毎個基因的mRNA表達量均與GAPDHmRNA表達量相比,引物序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Specific primer sequences for Real time PCR

1.2.4 Western blot檢測腎臟組織中蛋白表達 取0.1 g組織,加入預冷的RIPA組織裂解液,至于冰上用勻漿機充分裂解。4 ℃孵30 min,12000 r/min離心5 min(4 ℃),取上清液用BCA試劑盒測定其蛋白濃度。樣品經SDS-PAGE電泳,濕轉法轉膜2 h后轉至聚偏氧乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后,將上述PVDF膜放入適宜濃度的一抗中4 ℃孵育過夜。洗膜后以辣根過氧化物酶標記的二抗于室溫下孵育2 h。采用化學熒光法進行成像。以β-actin為內參分析各組目的蛋白的表達量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 硫酸軟骨素二糖對疲勞應激小鼠腎臟SOD活力和MDA含量的影響

疲勞應激損傷與組織中自由基的積累息息相關。當腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)無法有效清除組織中的自由基時,脂質過氧化產物丙二醛(MDA)產生增加,進而造成組織細胞損傷[10]。如圖1所示,與N組相比,疲勞應激下M組腎臟組織中的SOD活力略微下降,但無顯著性差異(p>0.05),而MDA的含量極顯著增加(p<0.01)。由此說明,M組建模成功,疲勞應激會導致機體的氧化應激損傷。當疲勞應激小鼠極顯著增加(p<0.01),灌胃硫酸軟骨素二糖后,S組小鼠腎臟組織中SOD活力顯著升高(p<0.05),而MDA含量極顯著下降(p<0.01)。硫酸軟骨素二糖也可以極顯著增加正常小鼠腎臟組織中的SOD活性(p<0.01),而對MDA含量無顯著性的影響(p>0.05)。因此可得,一定劑量的硫酸軟骨素二糖具有增加腎臟組織中SOD活性,改善機體氧化應激損傷的功效。

圖1 硫酸軟骨素二糖對小鼠腎臟中SOD酶活力和MDA含量的影響Fig.1 Effects of chondroitin disccharide on the activity of SOD activity and MDA content in kidney of mice注:*表示p<0.05,**表示p<0.01;圖2、圖3同。

2.2 硫酸軟骨素二糖對疲勞應激小鼠腎臟炎癥因子mRNA表達量的影響

如圖2所示,與N組相比,疲勞應激M組會極顯著增加TGF-β1和NF-κB的mRNA的表達量(p<0.01),進而極顯著增加下游IL-6和MCP-1mRNA的表達(p<0.01)。疲勞狀態下攝入硫酸軟骨素二糖后,與M組相比,S組小鼠腎臟中TGF-β1和NF-κB的mRNA的表達量無顯著性變化(p>0.05),而促炎因子IL-6和MCP-1mRNA表達量極顯著降低(p<0.01)。在正常狀態下,硫酸軟骨素二糖(CS組)對小鼠腎臟組織中炎癥因子的表達沒有顯著性的影響(p>0.05)。由此可知,一定劑量的硫酸軟骨素二糖的攝入可以改善疲勞誘導的促炎因子IL-6和MCP-的mRNA高表達。

圖2 硫酸軟骨素二糖對小鼠腎臟中炎癥因子mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of chondroitin disaccharides on the mRNA expression of proinflammatory cytokines in kidney of mice

2.3 硫酸軟骨素二糖對疲勞應激小鼠腎臟炎癥因子蛋白表達量的影響

如圖3所示,與N組相比,CS組的NF-κBp65、IL-6和MCP-1的蛋白表達水平無顯著性變化(p>0.05)。疲勞應激狀態下,M組小鼠腎臟中相關促炎因子NF-κBp65(p<0.05)、IL-6和MCP-1(p<0.01)的蛋白表達量顯著性增加;與M組相比,S組小鼠腎臟組織中NF-κBp65的蛋白表達量無顯著性變化(p>0.05),但IL-6和MCP-1蛋白表達量顯著性降低(p<0.05)。以上結果表明,一定劑量的硫酸軟骨素二糖可以降低腎臟由于疲勞應激引發的炎癥因子過表達,改善炎癥反應,保護腎臟。

圖3 小鼠腎臟中NF-κB p65、IL-6和MCP-1的蛋白相對表達量Fig.3 Relative protein expression of NF-κB p65、IL-6 and MCP-1 in kidney

3 討論與結論

疲勞損傷與機體炎癥和氧化應激緊密相關[11]。前期研究證明,疲勞應激狀態下,腎臟皮質呈現白色的缺血水腫狀態,組織腎小管形態出現嚴重損傷[12]。缺血的腎臟組織恢復血流后,組織則會產生氧化應激反應,這也是目前認為腎缺血再灌注損傷的機制之一。灌胃硫酸軟骨素二糖(150 mg/kg·bw)能夠極顯著改善疲勞導致的腎臟組織中抗氧化酶SOD活力并降低MDA含量(p<0.01)。此結果提示硫酸軟骨素二糖可以通過改善腎臟的氧化應激保護腎臟的疲勞損傷。

IL-6、MCP-1等炎癥因子表達會引起腎小管損傷,甚至導致組織壞死。IL-6是參與炎癥反應的重要因子之一[13],其濃度變化與腎臟的病理改變具有一致性[14]。MCP-1是機體中具有特異性趨化作用的趨化因子,其表達量在腎臟病變組織中極顯著增加(p<0.01)。本研究結果表明,疲勞應激組(M組)的腎臟組織中IL-6和MCP-1的基因和蛋白表達量均極顯著升高(p<0.01)。硫酸軟骨素二糖的攝入有效地降低了兩者的表達量。因而硫酸軟骨素二糖對腎臟組織炎癥具有明顯的改善作用。

綜上所述,一定劑量的硫酸軟骨素二糖對疲勞導致的小鼠腎臟炎癥具有明顯的改善效果,其改善作用可能與其緩解組織氧化應激相關。本研究為硫酸軟骨素二糖在改善腎臟應激損傷的功能食品開發中奠定了理論基礎。但是,硫酸軟骨素二糖的食用劑量以及長期服用后的毒副作用仍需要進一步研究,其保護腎臟的作用機制仍需要進一步探討。