高通量測序技術在環境微生物領域的應用與進展

艾 鑠， 張麗杰,b， 肖芃穎， 張曉鳳， 邢志林

(重慶理工大學 a.化學化工學院; b.藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

環境微生物決定了自然生態功能的強弱和特性，在能量流動、物質循環和系統穩定性維持等方面起著舉足輕重的作用[1-2]，對環境污染評估、污染治理、環境修復以及特種功能微生物篩選等領域具有指導意義。而微生物的群落結構及其多樣性是微生物生態學和環境科學研究的重點內容，對于開發生物資源，闡明微生物群落與其生境的關系，揭示群落結構與功能的聯系，從而指導微生物群落結構功能的定向調控具有重要價值。

微生物群落結構研究最早采用的是傳統培養分離方法，該方法存在著分辨率低、需培養等缺點。依照已有的培養技術和方法，只能對自然界中不到1%的微生物進行培養，如海水中為0.001%～0.1%，淡水中約為0.25%，土壤中約為0.3%[3]。隨后的熒光原位雜交(FISH)、末端限制性酶切片段長度多態性分析(T-RFLP)、變形梯度凝膠電泳(DGGE)、基因芯片技術等分子生物學技術雖能夠繞開分離和培養步驟，但受到樣品大小、采集等因素的影響[4]，且許多微生物需在分離培養后才能透徹地對其研究，這導致僅有1%～10%的環境微生物可以進行分析，依舊阻礙了環境微生物群落結構及多樣性的深入研究[5]。而當今廣泛使用的第二代測序技術(second generation sequencing,NGS)以及第三代測序技術(third generation sequencing,TGS)能夠克服上述分子生物學技術的缺點，且因其具有測序通量高、成本低、定量準的特點使其在生命科學領域中得到研究者們的肯定。據報道，科學家第一次進行人類基因組測序花費了40億元，耗時10年。而在2008年，利用第二代測序技術對人類全基因組進行測序，花費不到100萬美元，耗時3個月[6]。2012年，美國Life Technologies公司使用新的高通量測序平臺對人類全基因組進行測序僅需1天的時間，花費1 000美元[7]。

作為微生物生態學和環境工程學研究的重點領域，高通量測序技術使得直接研究自然狀態下微生物種群結構成為了現實。同時高通量測序技術有助于在礦山、廢水、海洋、土壤、大氣等差異性環境樣本研究中獲得了更加完整的DNA。這不僅有利于深入挖掘環境微生物的種類，還把對環境微生物的認識從物種水平上升到基因功能研究水平，極大地拓展了對環境微生物的認識[8-9]。經文獻調研可知，截止2014年，國內知網和國外Sciencedirect數據庫中高通量測序技術相關文獻數量分別約為700篇和3 000篇，但其中高通量測序技術與環境微生物的相關文獻數量分別僅占1.7%、2.1%，其余部分主要為人類學、植物學和動物學等方面。而全面介紹高通量測序技術在不同環境介質中應用的綜述文章還未見報道。

據此，為了更全面地了解高通量測序技術在環境微生物中的應用，筆者首先對高通量測序技術的發展進行了概述，然后從典型環境介質出發，結合最新成果和課題組研究進展，對高通量測序技術在大氣和空氣中的微生物變化、海洋微生物多樣性、污水生物處理以及土壤功能微生物等方面的應用進行了總結，以期為環境微生物領域的嶄新研究及工藝優化提供理論指導。

1 高通量測序技術及發展現狀

20世紀70年代Sanger等發明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Maxam等發明的Maxam-Gilbert化學降解法的出現拉開了第一代測序技術的序幕[10]，隨后又出現了熒光標記法和毛細管電泳技術[11]。然而雙脫氧核苷酸末端終止法和化學降解法操作步驟繁瑣，且不能自動化，而熒光標記法和毛細管電泳技術在成本和耗時方面遠遠不能滿足基礎學發展的需要。在隨后的30多年，生物測序技術取得了重大進展，特別是2005年出現的邊合成邊測序的454技術、2007年出現的邊合成邊測序的Illumina技術以及邊連接邊測序的SOLID技術[12]。以高通量為特點的第二代測序技術逐步成熟并商業化，其發展趨勢如圖1所示。以紅色為代表的454測序平臺的發展速度最快，從2005年到2011年其讀長從100 bp增加到800 bp，測序通量從35 Mb增加到700 Mb；以黃色為代表的Illumina測序平臺從2007年到2011年其讀長從35 bp增加到150 bp，測序通量從30 Gb增加到600 Gb；以藍色為代表的SOLID測序平臺從2007年到2010年其讀長從35 bp增加到85 bp，測序通量從13 Gb增加到320 Gb。這些技術是將片段化的基因進行接頭連接形成單鏈，然后用不同的方式進行PCR擴增產生更多的單分子序列。隨后通過引物雜交和酶的延伸實現序列的測定，檢測每一步反應所產生的信號來獲得測序數據，最后由計算機分析獲得完整的序列信息[13]。

2008年第三代測序技術浮出了水面，如Helicos biosciences的tSMSTM技術和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術[14]。第三代與第二代測序技術的特性比較如表1所示。總體而言，由于第三代測序技術采用單分子測序，具有更快的數據讀取速度，讀長普遍增加，運行時間大大縮短，且測序過程無需進行PCR擴增[15]。PacBio(SMRT)最長讀長可達到4 500 bp，比讀長最長的Roche 454平臺增長了 3 700 bp，其最短運行時間為0.5 h，比耗時短的Ion PGM減少了2.5 h。且PacBio(SMRT)也運用了邊合成邊測序的思想[16]，模板與DNA聚合酶結合，4種堿基(即是dNTP)用4色熒光來標記，在堿基配對階段，加入不同的堿基,會發出不同的光，根據光的波長和峰值來確定堿基類型。而表中Oxford Nanopore是利用電信號和一種具有共價分子接頭的特殊納米孔來測序[16]，DNA堿基通過納米孔時，會使電荷發生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度，電子設備通過檢測這些變化來鑒定所通過的堿基。可見，第三代測序技術比第二代測序技術在測序原理上也有較大的提升。但由于第三代測序技術還不成熟，國內外測序公司運用較少，華大基因等國內主要測序公司均以Illumina的HiSeq和MiSeq測序儀為主要測序平臺。

紅色：454測序平臺；黃色：Illumina測序平臺；藍色：SOLID測序平臺

表1 典型高通量測序平臺特性比較

2 高通量測序技術在氣體微生物中的應用

近年來，由于人類健康、空氣污染及環境質量等問題逐年增長，大氣微生物漸漸成為國內外研究的熱點。研究者已在大氣微生物的來源、大氣微生物污染與評價、環境因素對大氣微生物的影響和大氣微生物粒譜范圍等方面進行了大量研究。而如今，大氣微生物進入了群落多樣性的新研究領域。

2.1 室內空氣微生物群落多樣性研究

該領域研究的目的主要是通過分析室內空氣微生物群落結構及多樣性推測對人類健康的影響。相關研究目前還處在初級階段，國內的相關報道還較少。Hewitt等[25]通過對環境微生物的rRNA基因序列進行焦磷酸測序研究了3個大都市辦公室里的微生物多樣性，研究表明男女性之間的辦公室微生物豐度具有較大差異。該實驗同時運用了培養細胞計數法和高通量測序技術測定細菌豐度，突出了高通量測序評估微生物多樣性快速和徹底的優點，對研究者們在多種測序方法的結合使用方面有了一定的啟示作用。同年，Hewitt等還發現了人類對空間的占用會提高空氣微生物的濃度，這可能使人們對暴露于室內的某些感染與非感染的細菌產生不良健康后果[26]。該實驗充分展現了高通量測序技術在研究細菌基因組和進化種群特征方面的應用。此外，地理位置、建筑設計類型、采集器的選擇及空氣采集時間長短等因素都會影響微生物的群落結構及多樣性變化[27]，從而通過決定微生物組成和多樣性來理解其生態和進化關系。Hoisington等[28]利用高通量測序研究了采集器的選擇及不同采集時間內室內微生物的變化關系，以此來評估室內微生物因不同條件因素而產生的差異，這在室內微生物多樣性研究方面具有一定的參考價值。同時，一些研究者還對禽畜生活的室內環境微生物進行了研究，發現豬場建筑物中的微小氣候變化，特別是空氣流速、PM2.5和總懸浮顆粒的變化會嚴重影響細菌豐度及多樣性的變化，并發現冬季時六四環素耐藥基因出現的頻率比夏季高。隨著高通量測序技術的更加成熟，室內微生物群落多樣性研究可為人類健康提供更多的參考依據。

2.2 室外大氣微生物群落多樣性研究

由細菌、放線菌、霉菌、病毒和孢子等生命活性物質微粒組成的空氣微生物以微生物氣溶膠的形式游離于大氣環境中，是大氣生態系統的重要組成部分。近幾年，國內外許多研究者通過微生物氣溶膠對地球底層大氣和對流層上部等環境微生物的群落組成、多樣性、時空動力學以及其對生態系統的影響等方面展開了研究[29]。大氣中的主要微生物類型為細菌，且微生物的環境來源(如土壤、水體、植物)和季節變化是影響微生物群落結構變化的兩大主要因素[30]。Robert等[31]利用定量PCR和Illumina技術對意大利米蘭城市地區的大氣中細菌群落進行了研究，研究表明在冬季時細菌的豐度低于其他季節，細菌群落的優勢菌包括Actinobacteridae(放線菌亞綱)、Clostridiales(梭菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂桿菌目)，且大量微生物來源于土壤和植物中。Natasha DeLeon-Rodriguez等[32]研究加勒比海上層空氣的微生物群落，研究表明細菌為加勒比海上層空氣中的主要微生物類型，颶風氣溶膠中具有大量的新細胞，其中有17種細菌分類群利用C1-C4化合物作為生長源。

近年來，北京霧霾天氣受到研究者的高度重視，2013年清華大學環境學院和醫學院的研究人員利用Illumina HiSeq2000對霧霾空氣微生物宏基因組進行測序研究。該研究在種的分類水平上對細菌、真菌、古菌和dsDNA病毒等空氣微生物進行鑒定，發現霧霾空氣中約有1 300種微生物。其中PM2.5樣品中細菌讀數占86.1%，真核生物讀數占13%，古菌讀數占0.8%，病毒讀數占0.1%，而PM10樣品中細菌讀數占80.8%，真核生物讀數占18.3%，古菌讀數占0.8%，病毒讀數占0.1%，且大量微生物與土壤相關(圖2)。此外，這些微生物中雖大多數對人類不致病，但確定了幾種呼吸道過敏原和病原微生物的序列[33]。室外(特別是城市)大氣微生物結構及多樣性的研究，對深入理解城市空氣污染及其影響因素具有重要意義。尤其是高通量測序技術與宏基因組的完美結合，能夠進一步推進空氣環境治理研究，為大氣環境的污染治理提供了更豐富的生物信息。

從上述可知，高通量測序技術在氣體微生物中的應用已有一些報道，也體現出了高通量測序技術在群落結構及多樣性研究等方面發揮的巨大作用，但大多數只對氣體微生物直接的群落結構及多樣性研究，而對于高通量測序技術在大氣微生物功能菌的篩選等方面的應用還未見報。

圖2 收集的PM樣品特性

3 高通量測序技術在水環境微生物中的應用

3.1 原生環境中微生物多樣性變化研究

海洋微生物因在多種生源要素和能量傳遞方面的重要化學循環作用而成為研究者的主要研究領域。研究表明，在相同的水生環境中，不同深度的優勢微生物類群各不相同。譬如，北極水域表層水體微生物多樣性的優勢種為藍藻，深層水體(200～1 500 m)豐度最高的優勢種為變形菌門[34]。此外，微生物群落結構除隨時空變化外，還受溫度、pH值等其他環境條件影響。Maugeri等在Illumina測序技術的輔助下研究意大利Panarea島淺海熱液系統中微生物群落結構的組成及優勢菌，研究表明沉積物和流體中具有不同的群落結構，其優勢菌分別為Rhodovulum(小紅卵菌屬)和Chlorobium(綠菌屬)，且所獲得序列的原核生物對淺海熱系統中的C、Fe和S循環起著關鍵作用[35]。不同溫度下海洋熱帶地區中沉積物和海水中原核微生物群落結構及組成不同，研究發現Panarea島嶼的一個活躍的水熱地區在低溫和高溫的微生物群落的優勢菌都為細菌，微量菌都為古生菌，且不同溫度下的樣品具有不同優勢菌屬的數量比[36]。董逸等[37]利用高通量測序技術對我國黃東海典型海域進行微生物群落結構及環境變化對其影響的研究。研究表明：前5個月中，每月各水層具有相似的群落結構，而后6個月卻具有不同的微生物群落結構，其中溫度和鹽度對細菌群落結構的變化影響顯著。可見，除DNA測序技術中Sanger 測序法在海洋微生物中得到廣泛應用外，如今，高通量測序方法也越來越多地應用于海洋微生物生態學的研究。高通量測序技術能夠揭示海洋中極低豐度的微生物，發現更多新微生物類群，但在各分類階元都存在不能確定的分類信息。對此，可將熒光定量、克隆等技術與高通量測序技術結合，或將多種高通量技術結合使用，盡可能地減少測序結果的不確定性。

3.2 次生環境水體中微生物的多樣性研究

隨著城市生活垃圾的積累及工業生產中的廢水排放，水污染問題越來越嚴重[38]。水污染造成了水體營養負荷增加，破壞了藻類、無脊椎動物和魚類群落結構，同時也極大地影響了水中微生物的多樣性和群落結構。

2008年，研究人員就開展了利用磷焦測序研究污水處理廠的抗生素抗性質粒的研究[39]。到目前為止，已有許多關于廢水處理廠微生物及飲用水系統微生物方面的應用研究運用了高通量測序技術[40]。Man等[41]利用454焦磷酸測序技術研究具有不同處理方法的污水處理廠中的微生物群落。研究表明，Proteobacteria(變形桿菌)和Bacteroidetes(擬桿菌)是樣品中的優勢菌群，處理方法的差異可能改變微生物的群落結構。Zhang等[42]通過高通量測序技術研究了光合細菌作為添加劑對廢水處理系統中微生物群落結構及多樣性的影響。研究表明，添加光合細菌的樣品組比對照組具有更高的微生物多樣性，且能夠改善水質量。

Daisuke等[43]利用高通量測序技術對Kathmandu Valley地區的淺層地下水生物污染進行了研究，結果表明11個地下水樣品中有10個受到大腸桿菌的嚴重污染，此外DNA微陣列分析結果還揭示了37個病原種類的存在。Xiao等[44]利用454焦磷酸測序技術研究了農村生活污水以及制革廠、服裝廠和紐扣廠的排放污水對河流微生物生態系統的影響。結果表明，農村生活污水的細菌豐度最高，而制革廠的細菌豐度最低，且4種樣品中存在相似的微生物種類，可知不同廢水會潛在地影響河流生態系統的自然變化，導致河流生物同質化。同年，他們對特定豬場和農場飯店旁的河流微生物生態系統進行了研究[36]，發現豬場和農場飯店排放的污水使河流沉積物及河水的細菌多樣性和豐度都顯著降低，且豬場污染物對河流群落多樣性的影響較大。隨著高通量測序技術的廣泛應用，將會有更多的水體環境問題得以揭示，譬如消毒副產物對飲用水的生物多樣性影響、湖水中重金屬的遷移轉化問題等，相關成果也會為水處理系統的優化設計提供有益的指導。

4 高通量測序技術在土壤微生物中的應用

土壤微生物在分解轉化各種有機物和地球化學循環方面起著重要的作用[45]，其物種結構、遺傳多樣性和功能特性亦受到研究者的廣泛關注。據估計，每克土壤中最多可含有大約100億個微生物個體[46]，微生物種類和數量因土壤類型、季節變化、土層厚度與層次不同而發生變化，高通量測序技術為土壤多樣性的研究及土壤生態功能方面的研究提供了重要的技術支撐。

4.1 微生物群落的土壤理化性質響應

人類的生產生活改變了土壤本身的理化性質，造成土壤微生物群落演變。早期研究表明，草地和林地為土壤微生物提供充足能源，當草地或林地變為耕地后，其微生物量相對減少[47]。McGuire等[48]利用高通量測序技術發現再生的原始森林土壤中真菌的群落結構和功能變化顯著。而長期施肥則會改變土壤氮源和碳源的利用量，使得土壤微生物在土壤垂直梯度上具有明顯的群落結構差異[49]。卞碧云等[50]利用高通量測序技術研究氮肥對氨氧化微生物的影響，研究表明氮肥量的不同會使氨氧化細菌微生物群落結構產生明顯的差異，氨氧化古菌微生物群落結構基本穩定，而“活躍的”氨氧化細菌和古菌都會發生明顯變化，其中氮肥用量增加會對“活躍的”氨氧化細菌中Nitrosospira.splNsp 65-like group類群和Nitrosococcus watsonii sp.nov類群的生長分別產生抑制和促進作用。

借助高通量測序技術能夠多種環境因素同時分析，直觀全面地反映土壤微生物與生態條件的相互關系和影響，從而明細微生物群落結構的演變規律，豐富環境生態學知識，進而探索更有效的土壤管理方法，為人類合理利用土壤資源提供了有利依據。

SD：東萊蕪；GD：廣東深圳；SH：上海老港；CQ：重慶長生橋；OM：有機質；TN：總氮；TP：總磷；硝態氮；銨態氮

4.2 高通量測序技術在土壤功能微生物篩選方面的應用

土壤微生物長期在特定環境下具有了某些特定的功能，是環境生態系統中C、N和其他養分流的關鍵。研究表明氨氧化細菌控制著消化作用的主要步驟，對土壤生態系統的保持和移動性起著重要的作用，且氨氧化細菌在高底物和高營養條件負責了大部分的氨氧化反應[56]。在高通量測序技術的輔助下，研究者還對土壤中功能微生物進行了深入探究。徐瑛等[57]將脫硫菌的篩選與新一代高通量測序技術相結合，發現土壤中Pseudomonas(假單胞菌屬)、Ochrobactrum(蒼白桿菌屬)等多種脫硫功能菌。Kim等[58]在實驗室模擬垃圾填埋場甲烷降解的覆蓋層，通過基于DNA和RNA的核糖體標簽焦磷酸測序對細菌群落進分析研究，研究表明甲烷氧化菌活躍區域RNA占80%，而DNA占20%。DNA與RNA的比較表明只基于DNA的分析可能會低估甲烷氧化菌的活躍成分。課題組從礦化垃圾中富集混合菌群，并利用其靜息細胞進行了共代謝降解三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)的研究，結果表明該菌群對TCE有較強的親和力和耐受性，且TCE降解符合Monad模型[59]。隨后，課題組利用高通量測序技術對TCE馴化后典型垃圾填埋場覆蓋土中功能微生物進行了屬分類水平下的生物群落結構變化分析，結果見圖4。研究發現覆蓋土中Methylocystis(甲基孢囊菌屬)、Methylobacillus(甲基菌屬)、Methylophilaceae_uncultured(嗜甲基菌屬)、Arthrobacter(節桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)等多種共代謝TCE功能菌。此外，課題組開展了銅離子濃度對三氯乙烯好氧生物降解影響的研究。如表2所示，銅離子濃度的變化影響了覆蓋層混合菌群的結構和活性，進而影響了TCE降解機制。隨著銅離子濃度的增加，II型甲烷氧化菌Methylocystaceae百分含量(36.1%到75.42%)顯著增大，這說明了共代謝降解TCE成為了主要降解機制，而直接以TCE為碳源的Lactococcus(乳球菌屬)、Methylophilus(嗜甲基菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)等功能微生物的百分含量都顯著降低，甚至消失[60]。

利用高通量測序技術，能夠獲得土壤中微生物物種、結構、功能以及遺傳多樣性等方面的豐富信息，可根據樣品本身的群落結構設計功能菌的篩選方案，避免了傳統篩菌的盲目性。尤其是填埋場這種次生環境，在生活垃圾穩定化過程中蘊含了大量的功能微生物菌群，利用高通量測序技術能夠探索出覆蓋土功能菌篩選的新方法，相關成果將極大地拓展填埋場覆蓋土層功能微生物的工程應用前景。

圖4 屬分類水平下覆蓋土微生物群落結構變化

表2 銅離子處理覆蓋土混合菌的高通量測序結果

5 展望

高通量測序技術客觀地揭示了環境微生物的群落結構、多樣性及進化關系，使得微生物宏轉錄組和宏基因組等方面的基本研究策略發生變化，研究步驟得以簡化，研究周期得以縮短，并且能夠獲得更加豐富的數據。同時，它的發展為環境微生物在物質循環、生態系統調節及污染處理等方面的深入研究提供了機遇，也為極端環境下(如耐重金屬、PoPs持續性有機污染物)的功能微生物在耐受性馴化、代謝機理研究等方面提供了有力支撐。然而高通量測序技術也存在著一些缺點。

1) 它可能會高估或低估一些微生物類群的相對豐度及多樣性等，例如高通量測序針對環境中所有的DNA樣品，死的生物也可能被檢測到。將高通量測序技術與傳統技術的結合仍然具有很大的空間。

2) 高通量測序技術產生的海量數據分析難，這種海量數據使得生物信息學分析面臨挑戰，加大了土壤學或微生物學研究者對高通量測序結果分析的難度，新統計學方法和分析軟件的開發成為當前的迫切需求。

3) 高通量測序儀價格昂貴，動輒幾百萬元， 一般的小型實驗室難以承受。

雖然高通量測序技術過程中依然存在一些問題，但是其檢測快、通量高和信息豐富等特點，使其在微生物研究中的應用具有獨特優越性。所以應當謹慎地解釋分子技術所產生的微生物信息數據，結合多種分析方法得到更準確的結論。而海量數據的處理使得環境微生物學從生物學領域延伸到數學、自動化、計算機等許多科學領域，這必將拓展更多的新興研究領域，更好地發揮高通量測序技術的優勢。