熱堿法提取異養小球藻蛋白質工藝優化

胡守珍，畢生雷，黃麗麗，鄒婷婷，郭樂樂，楊迪，張乃群*

1 (南陽師范學院 生命科學與技術學院，河南 南陽,473061) 2 (河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南 南陽,473000)

小球藻(Chlorella)屬綠藻門,綠藻綱,綠藻目,卵胞藻科,小球藻屬[1]，有自養、異養、兼養3種培養方式[2-3]。小球藻在生產油脂的同時還能產生如蛋白質、小球藻生長因子、色素、多不飽和脂肪酸等高附加值產物[4-5]。小球藻中的蛋白質種類非常豐富，其氨基酸組成超過FDA頒布的用于人類食品的蛋白質標準[6]。小球藻生長因子不僅可以改善機體酸性環境，還能夠增強免疫力[7]、延緩衰老、更好更快修復受傷組織[8-10]。以藻蛋白為主的小球藻保健產品在日本、東南亞、我國臺灣地區每年銷售量都位居前列，具有很好的經濟前景[11]，而產油效率遠高于油料作物的小球藻也屢屢成為國家級科研資金資助的研究目標[12]。因此，隨著能源危機和糧食安全加劇，基于小球藻生產油脂、蛋白質等高附加值產品的技術受到人們的廣泛關注[13]，其中異養小球藻具有生長速度快、生物量高、含油量高、占用土地面積小[14]、能夠利用工業化設備實現藻體高密度規模化培養等特點受到研究人員重點關注[15-17]。但是由于異養小球藻產油技術的高成本導致該產業規模仍然較小[18-20]，如果能夠在提油之前將小球藻產生的蛋白質提取出來，不僅使小球藻物盡其用，還可以降低異養小球藻產油的生產成本[21-25]。

由于自養小球藻生產成本低、蛋白質含量和品質相對較高[26-27]，現有文獻關于小球藻蛋白質的提取聚焦于自養小球藻[28-30]，但是高產蛋白的自養小球藻含油量極少、規模化培養受到自然條件和場地限制較大，生產過程難以控制，會造成不同批次的產品質量差異較大[31-33]。相對于藻蛋白市場，藻油可用于制成食用油、生物柴油[34-36]、是用途廣泛、市場容量巨大的產品[37]，提取異養小球藻的蛋白質，有助于降低藻油的生產成本，從而為提高人類生活品質、解決人類生存問題作出貢獻[38]。本研究使用的異養培養的小球藻，原材料充足、藻體密度大、質量穩定，具有很好的研究價值和經濟意義[39]。

小球藻細胞壁堅韌，如果不能將其有效破碎，其中的營養成分難以被充分提取，因此小球藻細胞破碎技術至關重要[40]。目前國內外對于藻類細胞常用的破壁技術有超聲波法、高壓均質法、纖維素酶解等。曲文娟等[41]使用脈沖超聲技術提取鈍頂螺旋藻中的藻藍蛋白，蛋白得率為13.45%，比凍融法高10.26%。王曉琴等[42]利用高壓均質機對小球藻進行破壁，蛋白提取率為45.78%。陳藝煊等[43]使用纖維素酶對蛋白核小球藻進行破壁，破壁率為82.25%。但這些技術存在著處理量小、破壁效果差，且設備及材料成本較高、不適合規模化生產等缺點，因此尋找更為經濟有效的破壁方法勢在必行，本研究借鑒植物蛋白提取的常用的“堿提酸沉”法來提取異養小球藻中的蛋白質[44-45]，并進行工藝優化，旨在為異養小球藻高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異養小球藻藻粉(蛋白含量：12.163%，水分含量：1%)；

考馬斯亮藍、牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；NaOH、乙醇、H3PO4均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DGG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SKD-100型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；WFJ2100型分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；高速粉碎機，上海隆拓儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小球藻粉中水分含量的測定

按GB/T5009.3—2003.105 ℃恒重法(恒質量法)測得小球藻粉中水分含量為1%。

1.3.2 小球藻粉中蛋白質含量的測定

利用凱氏定氮法檢測。

1.3.3 提取液蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定，以牛血清蛋白(BSA)為標準品配制濃度梯度標準液，做標準曲線，然后依據標準曲線推測提取液樣品中蛋白質含量。

1.3.4 小球藻蛋白質提取率

小球藻蛋白質提取率按式(1)計算。

蛋白質提取率/%=

(1)

1.3.5 小球藻粉中蛋白質的提取流程

異養小球藻粉在電熱恒溫干燥箱中105 ℃烘干至衡重，取適量處理過的小球藻粉于錐形瓶中，按照設定的試驗條件來提取其中的蛋白質。

1.4 單因素試驗

1.4.1 NaOH的添加量對小球藻蛋白質提取率的影響

固定液料比為50∶1，提取溫度60 ℃，提取時間為1 h，分別在5%、10%、15%、20%、25%(質量分數)的NaOH添加量下進行試驗。

1.4.2 液料比對小球藻蛋白質提取率的影響

固定NaOH添加量為20%質量分數，提取溫度60 ℃，提取時間為1 h，分別在20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1的液料比下進行試驗。

1.4.3 提取時間對小球藻蛋白質提取率的影響

固定NaOH添加量為20%(質量分數)，液料比為50∶1，提取溫度60 ℃，分別在20、40、60、80、100、120 min的提取時間下進行試驗。

1.4.4 提取溫度對小球藻蛋白質提取率的影響

固定NaOH添加量為20%(質量分數)，液料比為50∶1，提取時間為40 min，分別在40、45、50、55、60、65、70 ℃的提取溫度下進行試驗。

1.5 正交實驗設計

根據單因素試驗結果，選取NaOH的添加量、液料比、提取時間、提取溫度4個因素作為試驗因素，以蛋白質提取率為指標設計試驗，采用L9(34)正交表，試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

2 結果與分析

2.1 蛋白質標準曲線

實驗測得蛋白的標準曲線為y=6.446 6x+0.023 9，R2=0.995 9。其中y為A595nm的數值，x為溶液中蛋白質的質量濃度。

圖1 牛血清蛋白質標準曲線Fig.1 Calibration curve of the bovine serum albumin

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 NaOH的添加量對小球藻蛋白質提取率的影響

堿溶液提取蛋白質過程中，pH值是影響蛋白質提取效果的重要因素，但是在提取過程中pH值會發生變化，且不易控制，因此選擇NaOH的添加量進行研究更為方便可行[46]。由圖2可以看出，NaOH的添加量對小球藻蛋白質的提取率有較大的影響，在NaOH的添加量比較小的時候，蛋白質的提取率比較低，并且蛋白質的提取率隨著NaOH的添加量的增加而提高，因為在堿性環境中，蛋白質分子的結構由緊密變為疏松，蛋白質分子之間相互排斥，同時堿性溶液會破壞蛋白質分子的次級鍵尤其是氫鍵，這些作用會使蛋白質溶解性增加，并且這種增溶作用會隨著NaOH添加量的增加而增強[47]，所以蛋白質提取率隨著NaOH添加量的增加而上升。但是當NaOH的添加量超過20%并且繼續增加時，蛋白質的提取率不升反降，并有異味產生，可能是因為NaOH添加量過高造成了蛋白質過度水解，部分氨基酸發生縮合反應產生異味物質[48]。江懷真等[49]利用熱堿法提取小球藻蛋白質，在NaOH的添加量為15%(質量分數)時，蛋白質提取率約為43%，本實驗為39.19%，可能是因為江懷真等人試驗所用小球藻粉蛋白含量(55.8%)高于本實驗(12.163%)，提取液蛋白質含量測定使用的是凱氏定氮法，而本實驗使用考馬斯亮藍G-250法測定，因此本實驗蛋白質提取率與之對比相對較低。NaOH添加量的單因素試驗結果與江的相當，因此，NaOH的最佳添加量定為20%(質量分數)。

圖2 NaOH的添加量對小球藻蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of the adding ratio of NaOH on the extractionof the chlorella protien

2.2.2 液料比對小球藻蛋白質提取率的影響

由圖3可以看出，液料比對小球藻蛋白質提取率也有較大的影響，液料比較小時蛋白質提取率較低，可能是因為加水量太少溶液黏稠，分子擴散速度慢，影響蛋白質分子的溶解。當液料比從20∶1增大到50∶1時，蛋白質提取率提高比較明顯，由32.26%提高至43.96%，等量蛋白質由過飽和狀態變為不飽和狀態，所以蛋白質溶解性增加[50]。而當液料比從50∶1增大到80∶1，料液比幾乎增大了1倍，但是蛋白質提取率卻只提高了3.38%，盡管提取率仍然有所提高，但是結合生產實際，較高的液料比會導致蛋白質濃度過低，提取過程中的損耗會增大，而且會造成后期蛋白質的純化難度大大增加[51]，因此選擇液料比為50∶1。

圖3 液料比對小球藻蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of the liquid-solid ratio on the extraction ofthe chlorella protien

2.2.3 提取時間對小球藻蛋白質提取率的影響

由圖4可知，熱堿法對小球藻細胞壁的破壞作用較強，提取20 min時，蛋白質提取率已經達到45.74%，隨著提取時間的延長，蛋白質提取率繼續增加，在40 min時提取率達到最高，為50.42%，此時小球藻中的大部分蛋白質已經溶出，因為超過40 min后，蛋白質的提取率開始緩慢下降，這表明蛋白質的溶出過程與時間密切相關，提取時間太短，蛋白質溶解不充分，提取時間過長，又會造成蛋白質的變性或者其他組分溶出量增大，使得蛋白質提取率降低[52]。所以選擇提取時間為40 min。

圖4 提取時間對小球藻蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of the time on the extraction of the chlorellaprotien

2.2.4 提取溫度對小球藻蛋白質提取率的影響

溫度直接影響物質在溶液中的溶解性，因此溫度對蛋白質提取率有顯著的影響。由圖5可知，在溫度為40～50 ℃，蛋白質提取率基本沒有變化，可能是溫度較低，小球藻的細胞壁未能有效破碎，但是在溫度為50～60 ℃，蛋白質提取率隨著溫度的升高迅速提高，在溫度為60 ℃時提取率達到最高，為53.16%，可能是由于在該溫度范圍內蛋白質分子結構發生變化，立體結構舒展，與水的相互作用增強[47]，蛋白質溶出量增大。溫度超過60 ℃以后，蛋白質提取率不升反降，可能是由于溫度過高造成蛋白質變性，這與前人的研究結果一致[53]。所以提取溫度取60 ℃。

圖5 提取時間對小球藻蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of the temperature on the extraction of thechlorella protien

2.3 正交試驗結果

為了比較NaOH的添加量、液料比、提取時間、提取溫度4個因素對小球藻蛋白質提取率的影響，使用正交試驗法來確定小球藻蛋白質的最佳提取條件，試驗設計及結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

由正交試驗R值分析可知，4個因素對小球藻蛋白質提取率的影響次序為A>B>D>C,即NaOH添加量>液料比>提取溫度>提取時間，進一步的方差分析表明(表3)，4個因素中，提取時間對小球藻蛋白質的提取有顯著影響，最優組合為A2B2C1D2，即NaOH添加量20%(質量分數)，液料比50∶1，提取時間20 min，提取溫度60 ℃。以該自由組合條件進行驗證試驗，得出在該條件下小球藻蛋白質提取率為54.98%，與正交試驗中提取率最高的一組A2B2C3D1進行比較，可知小球藻最佳提取條件為A2B2C3D1，即NaOH添加量20%，液料比50∶1，提取時間60 min，提取溫度55 ℃，此條件下小球藻蛋白質的提取率可達55.24%。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3 結論

藻類細胞破碎方法有很多，但常用的藻類細胞破碎方法多不適合工業化應用，本文參考植物蛋白提取常用的“堿提酸沉法”來提取異養小球藻粉中的蛋白質，研究了熱堿法提取小球藻蛋白質的條件，經單因素試驗和正交試驗對熱堿法提取小球藻蛋白質的提取工藝進行了優化，得到熱堿法提取小球藻蛋白質的最佳條件為：NaOH添加量20%(質量分數)，液料比50∶1，提取時間60 min，提取溫度55 ℃，此條件下小球藻蛋白質的提取率可達55.24%。此法所用儀器簡單、操作簡便易行、處理量大、提取效果明顯、成本低，且在后續蛋白質的提純過程中可加入HCl來調節等電點使蛋白質沉淀，并且中和了提取過程中添加的堿，不會對環境造成污染，也不影響提取出來的蛋白質作為保健品來食用，因此該法非常適合工業化應用，具有很好的應用前景，本研究為異養小球藻產油技術經濟最大化提供了參考。