釀酒葡萄品種遺傳多樣性的簡單序列重復分析和分子身份證的建立

馬文瑞，嚴密，劉業偉，江偉，全莉，王雪薇，武運*，薛潔*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 3(中國農業大學，北京，100083)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL.)，分布于世界溫帶、亞熱帶，不僅可以鮮食，還能釀酒、制汁和制干，是重要的經濟作物[1-2]。現在有一定栽培面積的優良品種主要為赤霞珠、美樂、霞多麗等[3-5]。隨著我國葡萄酒產業發展，每年還有新品種不斷引進，因此進行釀酒葡萄種質資源鑒定保護和葡萄酒鑒偽是我國葡萄酒行業規范發展和質量監控的重要措施。

葡萄繁殖方式主要為無性繁殖，不同葡萄酒產區間互相引種，并對外來優良新品種的引進，出現同名異物，同物異名等品種混淆問題，又因葡萄種間雜交過程中產生中間型和過渡型雜種的概率較高[6]。面對葡萄品種間極其豐富的多樣性變異，傳統的鑒定方法已經受到諸多限制，然而DNA指紋圖譜技術的發展解決了這一問題。該技術能夠從分子水平檢測基因組中的遺傳信息和序列多態性，兼備特異性和穩定性都較高的特點，能夠快速對親緣關系較近的種質個體進行鑒定[7]。

簡單序列重復 (simple sequence repeats, SSR)技術也稱微衛星技術，是目前廣泛應用于植物種質資源鑒定、保護、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜建立等方面的DNA指紋圖譜分析技術。該技術具有共顯性、靈敏度高、多態性高和重復性好等優點，可為植物種質資源遺傳多樣性分析，建立品種SSR指紋圖譜提供便利[8-9]。溫景輝等人利用SSR標記技術對20份葡萄原料進行了種質親緣關系分析，所有種質總共分為4大類群，其中，親緣關系較遠的類群是山葡萄與歐亞種、美洲雜種，親緣關系較近的類群是歐亞種與美洲種[10]。劉偉等人利用15對SSR引物對 21 種不同類型葡萄種質進行PCR擴增，對其遺傳多樣性進行了分析，SSR標記技術能夠從分子水平上解析不同類型葡萄種質的遺傳差異性，并能揭示材料間親緣關系[11]。王慧玲等人利用9對SSR引物對13個新葡萄品種進行SSR分析，最終得到所有品種分子身份證，能夠將所有供試材料有效區分[12]。樊秀彩等人篩選出能擴增出父本特異性條帶的7對SSR引物對239株山葡萄和河岸葡萄的雜交后代進行鑒定，161株后代具有父本的特異性條帶，另外，后代中還出現了新的條帶，表明雜交后代產生了豐富的變異[13]。

本研究選取新疆天山北麓葡萄酒產區10個優良紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標記分析技術，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠擴增片段圖譜，分析紅白釀酒葡萄品種之間的親緣關系，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取新疆天山北麓葡萄酒產區的10個優良釀酒葡萄品種果實(表1)，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

表1 十個釀酒葡萄品種及其分子身份證編碼Table 1 Ten Vitis vinifera varieties and its molecular ID

10×PCR buffer[100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2]，dNTPs，TaqDNA聚合酶和6×Loading Buffer等購買于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；D2000 DNA marker購買于天根生化科技(北京)有限公司；所有PCR引

物，毛細管電泳所用引物5′-FAM(藍色)標記均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HIDI，LIZ500購買于美國 ABI 公司；其他試劑均為分析純購自北京化工廠。

1.2 儀器與設備

測序列分析儀(3730XL)，美國 ABI 公司；VeritiTM96-Well Thermal Cycler 梯度PCR儀，美國ABI公司；垂直電泳槽(JY-CZ-BL)，北京君意東方電泳設備有限公司；電泳儀(BG-Power600)，北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像系統(Tanon 1600)，天能科技(上海)有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒葡萄品種總DNA提取及質量檢測

根據葡萄特性，將傳統的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)進行改良，有效提高了葡萄總DNA的質量。具體步驟參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》[14]。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小和質量，并使用核酸蛋白儀檢測樣品總DNA的濃度和純度，將樣品濃度稀釋至40 ng/μL。

1.3.2 PCR擴增和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

本研究根據葡萄公共遺傳圖譜NCBI，確定選用12對國際通用的SSR引物用于PCR擴增，引物序列見表2。

表2 十二對SSR引物及其退火溫度Table 2 Twelve sequence and annealing temperature of SSR primer

注：F-上游引物；R-下游引物；Tm-退火溫度。

釀酒葡萄普通SSR-PCR擴增反應，采用25 μL反應體系，其中包含有Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補足[18]。

SSR-PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度60 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。

SSR-PCR擴增產物，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V，120 min。銀染顯色主要操作如下：染色 15 min，蒸餾水沖洗1～2次，顯色5 min，再次用蒸餾水沖洗1～2次，直至條帶清晰為止。

1.3.3 PCR擴增和毛細管電泳檢測

綜合1.3.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜結果和經濟成本角度考慮，最終選取多態性良好，重復性較好的5對SSR引物進行正向引物的5′-FAM標記，它們分別是VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2。

釀酒葡萄SSR-PCR擴增反應，采用25 μL反應體系，其中包含有Mg2+濃度2.0 mmol/L，dNTPs為0.2 mmol/L，Taq酶為1.0 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補足。SSR-PCR反應程序第一階段：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s ，72 ℃延伸30 s，共10個循環。第二階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20個循環，最后72 ℃修復延伸6 min。

SSR-PCR擴增反應產物，采用毛細管電泳法進行檢測。具體步驟如下：吸取990 μL HIDI和10 μL LIZ500進行混勻，然后吸取10 μL混合物加入到96孔反應板中；迅速將96孔板置于平板離心機中，離心到500×g結束；對照上機檢測表，在96孔板對應的孔中加入相對應的50 pg樣品；再次將96孔板置于平板離心機中，離心到500×g結束；使用封板膜密封96孔板，振蕩，再次離心到500×g結束；置于PCR儀中；變性程序為98 ℃，5 min，不加熱蓋，程序結束后立即冷卻96孔板；然后將96孔板置于平板離心機中，離心到2 000×g結束；最后將PCR產物使用ABI 3730XL全自動基因分析儀進行檢測分析。

1.3.4 數據分析

SSR-PCR產物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后拍照，根據電泳圖譜多態性條帶并賦值分析。相同電泳遷移率下的清晰條帶賦值為“1”，無擴增條帶的記為“0”，擴增條帶不清晰將不進行統計，最終得到0/1數據矩陣結果，再利用NTSYSpc2.10e軟件進行后續分析，不同釀酒葡萄品種之間的遺傳相似系數利用NTSYSpc2.10e軟件得出結果。首先利用軟件中Similarity中的Qualitative Date功能計算不同品種間的遺傳相似系數，然后采用非加權類平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)進行聚類分析，最終利用Graphics功能得出聚類分析樹狀圖。根據SSR-PCR非變性聚丙烯酰胺凝膠圖譜，將所有品種不用引物的譜帶進行有序編碼轉換，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。根據每對引物對不同品種有效譜帶分子量大小，從小到大有序編碼為1～9，如果條帶數超過9條，依次增加A～Z進行編碼。如果SSR引物在其中一個樣品中擴增出多個等位片段，選擇分子量較小的分子量對其編碼[19]。

根據ABI 3730XL出現的峰圖與內標LIZ500 進行比較，根據峰面積和出峰時間得出每個樣品在SSR位點的片段大小，使用Genemapper軟件分析樣品SSR數據，具體分析步驟參照尹玲等人的《我國新育成葡萄品種SSR指紋圖譜的建立》[20]。最終得出釀酒葡萄品種在SSR位點的熒光指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多態性分析

根據葡萄果實特性改良的 CTAB法提取總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀測定樣品DNA的質量，結果顯示樣品的DNA 的濃度和純度已達到SSR分子標記要求，并將所有樣品的DNA濃度稀釋至40 ng/μL。SSR-PCR的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示，所有品種擴增條帶清晰。本試驗利用12對SSR引物在供試材料中檢測到56個等位基因，SSR引物擴增的條帶范圍為13～28條，平均17.75條。片段長度介于100～800 bp，200～500 bp擴增片段較多。引物VVMD27擴增出 13 條條帶，是擴增條帶數最少的引物；VVMD8是擴增條帶數最多的引物，多達 28 條。引物 VrZAG64擴增片段分子量范圍最大，為150～800 bp；引物 VVS2擴增片段分子量范圍最小，為140～340 bp。12對SSR引物共擴增213條擴增片段，均為多態性條帶，多態性百分率為 100%，具體見表3。

2.2 釀酒葡萄品種的遺傳相似系數分析

本研究根據圖譜結果，得出 0/1矩陣統計結果，對不同品種之間的遺傳距離進行了計算，結果見表4。10個釀酒品種中，不同樣品間的遺傳相似系數變化范圍在0.67～0.85之間，平均遺傳相似系數為0.76。其中“赤霞珠”和“美樂”之間遺傳相似系數最高，為0.85，“小芒森”與“貴人香”，遺傳相似系數相對最低，為0.67。

表3 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的SSR-PCR 擴增產物多態性比較Table 3 Comparison of the polymorphism of SSR-PCR amplified products of 10 Vitis vinifera varieties withdifferent SSR primers

2.3 不同釀酒葡萄品種的SSR聚類分析

以所有樣品的擴增圖譜為基礎，根據0/1數據矩陣結果，使用NTSYSpc2.10e軟件進行UPGMA法聚類分析得出 10個釀酒葡萄品種的聚類樹狀圖，見圖1。結果顯示10個樣品在遺傳相似系數 0.73處產生了分離，將所有10份試驗樣品分成 2類。

第 1個大類包含有所有的紅葡萄品種，占所有樣品的70%，當遺傳相似系數是0.76時，又分成了3個亞類，第1個亞類是“赤霞珠”和“美樂”，第2個亞類是“蛇龍珠”和“品麗珠”，均為歐亞種，這4個品種相對較近，原因是“品麗珠”是“赤霞珠”，“美樂”和“蛇龍珠”的親本之一。第3個亞類是“西拉”，“馬瑟蘭”和“小芒森”，其親緣關系與第1和第2個亞類相對較遠。

第2個大類包含白葡萄品種和麝香葡萄，在遺傳相似系數 0.78時，又分成了2個亞類，第1個亞類有“霞多麗”和“貴人香”，第2個亞類是“玫瑰香”，單獨為一個分支。

表4 十個釀酒葡萄品種的遺傳相似系數Table 4 Genetic diversity of 10 Vitis vinifera varieties

圖1 基于SSR標記的10個釀酒葡萄品種聚類分析樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 10 Vitis vinifera varieties based on SSR results

2.4 釀酒葡萄品種分子身份證構建

12對引物對10個釀酒葡萄品種擴增的等位基因譜帶大小分布范圍及賦值標準見表5。用篩選出的12對引物按照多樣性指數由低到高的順序進行區分，其中前6對引物就可以區分所有的試驗樣品，并構建了10個釀酒葡萄品種分子身份證編碼，具體見表1。在所有引物擴增的結果中，每個品種最少有1個特異等位基因，如引物VrZAG79擴增結果顯示，“赤霞珠”，“美樂”，“西拉”，“馬瑟蘭”和“霞多麗”均有1個特異等位基因。如引物VVS2擴增結果顯示，“霞多麗”，“貴人香”，“玫瑰香”，“小芒森”，“蛇龍珠”，“西拉”和“馬瑟蘭”均有1個特異等位基因。

2.5 釀酒葡萄品種熒光標記DNA指紋圖譜的建立

5對5′-FAM標記的SSR引物VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2，對所有供試品種進行毛細管電泳。基于每個引物 PCR 產物片段大小，根據毛細管電泳峰圖的峰型以及每個峰值的大小建立，10個不同釀酒葡萄品種基于5對SSR 引物的分子標記圖譜，圖2為部分釀酒葡萄品種在熒光標記VrZAG79位點上的毛細管電泳譜圖。

表5 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的擴增產物片段大小及賦值標準Table 5 Alleles size range amplified of 10 Vitis vinifera varieties by SSR and encoded standard

圖2 部分釀酒葡萄品種在熒光標記VrZAG79位點上的毛細管電泳圖譜Fig.2 Capillary electrophoresis of VrZAG79 loci for some Vitis vinifera varieties

3 討論與結論

隨著分子標記技術和基因測序技術的快速發展，隨機擴增片段多態性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 、SSR、簡單序列重復區間(inter-simple sequence repeat, ISSR)和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)等分子標記技術已經廣泛應用于物種的起源、演化以及遺傳變異等相關研究，在水稻[21]、大麥[22]、玉米[23]、苦瓜[24]、杏[25]、桃[26]等許多材料上均有報道。相對于傳統的形態學標記技術，分子標記技術對物種的親緣關系進行分析更加直接準確。SSR標記是一種共顯性分子標記，其檢測所需DNA量少，且耗時短，多態性好，重復性好，信息量大，能夠高效精準地對親緣關系相對較近的品種或個體進行分析鑒定，從而在葡萄種質遺傳多樣性分析，葡萄品種資源保護鑒定和DNA指紋圖譜構建等方面得到了較廣泛的應用。但應用 SSR標記進行紅白釀酒葡萄品種間的遺傳多樣性和指紋圖譜建立研究相對較少，同時由于釀酒葡萄種質的親緣關系較近，仍有很多優良種質未得到評價與鑒定。本研究特選取紅白釀酒葡萄品種進行品種間遺傳多樣性分析和分子身份證的建立[27]。

種質資源的遺傳多樣性能夠反映個體在特定生長環境下基因的豐富程度，是品種種質研究工作中的基礎，因此品種間親緣關系分析和指紋圖譜構建對于品種選育，鑒定和保護有重要意義[28]。郭印山等人利用49對SSR引物對20 份葡萄材料進行了親緣關系分析，研究數據顯示，遺傳相似系數為0.672時，所有葡萄品種分為3大類群。第1大類包括2份歐美雜種和1份美洲種；第2大類為8份歐亞種葡萄品種；第三大類包括2份山歐雜種和2份山葡萄品種[29]。董志剛等人采用SSR標記技術對15份葡萄種質進行了聚類分析，結果顯示，將其分成兩大類，第1大類是山歐雜種，第2大類是歐亞種和歐美雜種[30]。由以上前人研究結果可見，歐亞種和美洲種這2個葡萄種質類群的親緣關系相對較近，而山葡萄與二者親緣關系相對較遠。本試驗以10個紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標記探討紅白釀酒葡萄品種的親緣關系，聚類分析結果顯示，所有試驗釀酒葡萄品種親緣關系較近，在遺傳相似系數 0.73處產生了分離，將所有樣品分成 2類，第1大類包含所有紅葡萄品種，第2大類包含所有白葡萄品種。其中小芒森聚為第1大類，原因可能是其親本之一為紅葡萄品種。

利用SSR分子標記技術構建葡萄品種的 DNA 指紋圖譜，可為保護優良葡萄品種種質資源、鑒定和檢測葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度提供了客觀科學的參考依據。DNA指紋圖譜分析常用的方法為特征譜帶法和引物組合法，兩者結合則大大提高了鑒別效率。成冰等人利用14對SSR引物對13個釀酒白葡萄品種進行擴增，結果顯示特異性條帶率為25.00%，其中，VrZAG79條帶總數，多態性條帶和特異性條帶均為最多，且所有品種的遺傳差異性較大。2個引物VrZAG62和VVIb66可分別鑒定所有試驗品種[31]。杜晶晶等人利用9對引物對80份葡萄種質資源進行分子身份證編碼，并能夠區分所有品種，表明 SSR 標記技術可以高效鑒定葡萄品種[19]。尹玲等人對國內24個新葡萄品種，利用6對SSR熒光標記引物進行毛細管電泳，能夠明確區分所有供試品種，并建立其指紋圖譜[20]。本試驗利用6對SSR引物對10個紅白釀酒葡萄品種進行等位基因賦值并構建了供試材料的分子身份證編碼，其中，10個品種均有特征性引物，VVS2是7個品種的特征性引物。同時篩選出5對多態性高，穩定性好的SSR引物熒光標記并進行毛細管電泳，得出10個釀酒葡萄品種的SSR標記的熒光圖譜。

本試驗利用12對SSR引物對10個釀酒葡萄品種進行了遺傳多樣性研究，由親緣關系遠近將其分成2個類群。并依據所有樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，選用6對引物對所有試驗材料進行了分子身份證編碼，研究表明 SSR標記從分子水平上解析了紅白釀酒葡萄品種的遺傳多樣性，一定程度上對釀酒葡萄品種選育，鑒定和保護有重要意義。同時，采用了5＇-FAM熒光標記 SSR引物和毛細管電泳技術，最終得出的10個釀酒葡萄品種的SSR熒光圖譜，有利于豐富國際葡萄品種數據庫，也對葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度的檢測提供了參考依據。