固相萃取整體捕集劑-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀結合電子鼻技術對中華絨螯蟹關鍵脂質(zhì)熱氧化體系的構建

付雪艷，吳娜，袁凱，王錫昌*

1 (上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌，330045)

中華絨螯蟹是中國傳統(tǒng)的淡水養(yǎng)殖甲殼類水生動物，俗稱河蟹，系大宗名貴水產(chǎn)品之一。中華絨螯蟹味道鮮美、營養(yǎng)豐富，這與其豐富的脂肪和蛋白質(zhì)含量組成密切相關，其中中華絨螯蟹的脂肪含量占總營養(yǎng)成分的13.33%[1]，在水產(chǎn)品中位居前列(貝類占2.71%，刀鱭占6.42%，海蟹占4.80%[2-4])。目前有關中華絨螯蟹基本營養(yǎng)成分、脂肪酸、氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)等的研究已日益成熟，但是有關脂質(zhì)熱氧化降解對中華絨螯蟹揮發(fā)性物質(zhì)的作用的研究還很少見。脂質(zhì)主要包括以磷脂為主的極性脂和由甘油三酯、游離脂肪酸和膽固醇等組成的中性脂。磷脂、甘油三酯和游離脂肪酸是脂質(zhì)中對香氣貢獻最大的三種組分[5-6]。這些香氣物質(zhì)多是一些醛、酮、醇等小分子化合物，其中很多化合物具有良好的風味特征[7]。

不少研究旨在探究脂質(zhì)降解與揮發(fā)性物質(zhì)生成的關聯(lián)，但還僅限于不同加工處理前后脂肪酸組成與揮發(fā)性成分的關聯(lián)性分析[8-9]，以及不同可食部位脂質(zhì)組成變化及對揮發(fā)性成分的影響上[10-11]。基于本研究團隊之前對中華絨螯蟹在熱處理前后不同脂質(zhì)組分含量變化的研究[12]，發(fā)現(xiàn)雌蟹性腺中的甘油三酯(triglyceride, TG)、甘油二酯(diglyceride, DG)和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)以及雌蟹肝胰腺中的游離脂肪酸(FFA)和磷脂酰膽堿(phosphatidyl ethanolamine, PE)在蒸制之后出現(xiàn)顯著下降，由此推斷這幾種脂質(zhì)為其相應可食部位對揮發(fā)性物質(zhì)貢獻顯著的關鍵脂質(zhì)。TG作為性腺中含量最多的脂質(zhì)[13]，其在熱處理過程中很不穩(wěn)定，酰基鏈上的脂肪酸極易氧化降解，特別是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)。其降解產(chǎn)物可能是DG和FFA，因此DG和FFA的變化就變得很復雜，一方面會因為中性脂和極性脂的不斷降解而增加，另一方面自身也會發(fā)生降解，最終其含量下降，說明其降解速率遠大于生成速率。SWEETEN[14]和DUCKETT[15]等的研究表明中性脂和極性脂由不同的脂肪酸組成，其中PUFA主要集中在極性脂上。倪逸群等[10]研究發(fā)現(xiàn)，極性脂中的C18∶1n-9c、C20∶1n-9、C20∶4n-6和C22∶6n-3脂肪酸對揮發(fā)性化合物的形成貢獻顯著，因此PE更容易發(fā)生降解。考慮到TG的量多且提取過程相對簡單[16]，PE的量多且下降明顯[11]，本實驗主要針對性腺TG和肝胰腺PE進行熱氧化體系的構建。基于此基礎筆者通過研究建立雌蟹性腺和肝胰腺關鍵脂質(zhì)的熱氧化體系，為后續(xù)脂質(zhì)熱氧化降解特性的研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

50只雌性中華絨螯蟹(150 g左右)于2015年10月采自上海市崇明中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地。捕撈后的活蟹立即用棉線扎緊，置于帶有冰塊的泡沫箱中，于2 h之內(nèi)運送至實驗室。清水沖洗后擦拭，活體剝離其性腺和肝胰腺，分別分裝后置于-40 ℃超低溫冰箱中儲藏備用。

試劑：氯仿、甲醇、二氯甲烷、正己烷、無水乙醚，以上均為分析純，國藥集團化學試劑公司；2, 4, 6-三甲基吡啶(純度>98.0%),東京化成工業(yè)株式會社Trimethyl pyride, TMP；

電子鼻Fox 4000，法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；圓柱形萃取吸附-熱脫附吸附子MonoTrap RCC18(2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm)，日本GL Sciences 公司；熱脫附器TDU、多功能進樣器MPS、冷卻型進樣口CIS，德國Gerstel 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA集團；Silicic酸性硅膠柱(Kieselgel 60, 70目-230目)，德國默克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

分別稱取3 g性腺和肝胰腺于20 mL帶有橡膠墊片的棕色頂空瓶中(n=3)，經(jīng)熱處理[17](時間：0、5、10、15、20、25、30 min; 溫度：60、70、80、90、100 ℃)后立即冷卻，用于GC-MS檢測。

分別稱取1 mg TG(添加水分6.15 μL)和12 mg性腺以及1 mg PE(添加水分15.19 μL)和31.15 mg肝胰腺于10 mL頂空瓶中[11](n=3)，經(jīng)上述熱處理后立即冷卻，用于電子鼻分析。

1.2.2 揮發(fā)性氣味物質(zhì)的測定

取上述分別經(jīng)過熱處理后的樣品，加入2 μL濃度為10-5g/mL的TMP作為內(nèi)標[18-19]，將3個老化并清洗后(保證沒有雜質(zhì)及殘留)的吸附材料(MonoTrap RCC18)用固定裝置串聯(lián)后置于頂空瓶中樣品上方，于50℃吸附萃取30 min，以保證樣品中揮發(fā)性氣味物質(zhì)萃取完全。然后將吸附材料從固定裝置上取下，并迅速裝入熱脫附玻璃襯管中，由多功能進樣器(MPS)將MonoTrap轉(zhuǎn)移至熱脫附器(TDU)中熱脫附，通過-40 ℃液氮冷阱(CIS)進行組分匯集，然后在高溫條件下汽化，進入儀器檢測。

實驗采用DB-5MS彈性毛細管柱(30 m×0.25 mm, 液膜厚度1 μm)；程序升溫參數(shù)參照ZHUANG, WU等研究[20-21]；采用不分流模式，流速1.2 mL/min，汽化室溫度240 ℃。

1.2.3 脂質(zhì)的提取

1.2.3.1 總脂的提取

參照FOLCH[22]的方法，分別稱取(10.00±0.50)g雌蟹性腺和肝胰腺于燒杯中，經(jīng)20倍體積的氯仿、甲醇(體積比為2∶1)于4 ℃下靜置提取24 h，經(jīng)濾紙反復過濾，然后用0.03 mol/L MgCl2溶液于4 ℃反復萃取后，移除上層甲醇層，將氯仿層轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，于40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除溶劑至恒重，即得總脂肪。

1.2.3.2 關鍵脂質(zhì)的提取

參照SAITO[16]的方法，稱取(10.00±0.50)g填料(silica gel 60 0.063 mm～0.200 mm)于酸性硅膠柱中，V(加入二氯甲烷)∶V(正己烷)=2∶3溶液200 mL用來活化柱子，然后加入0.5 g總脂肪，緊接著按照表1順序分離不同脂質(zhì)組分：

表1 不同脂質(zhì)組分洗脫程序[16]Table 1 Elution program of different lipid fractions

注：一些組分中會包含其他組分。

1.2.4 電子鼻分析

本實驗采用含有18根傳感器(分別為：組A：T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2；組B：P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、TA/2；組C：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/g CTL、LY2/g CT)的Fox 4000 電子鼻，其能夠系統(tǒng)的對河蟹樣品進行整體氣味輪廓區(qū)分。為了使各個樣品保持狀態(tài)的統(tǒng)一，將稱好的樣品置于自動進樣系統(tǒng)的低溫托盤(4 ℃)上。采用動態(tài)頂空法采集氣體，進樣前樣品置于50 ℃平衡600 s以保證樣品釋放完全并均勻分散，進樣器溫度60 ℃，進樣體積2 500 μL，1 s進樣，以干凈空氣作為載氣，流速為150 mL/min，數(shù)據(jù)采集時間120 s，在進行下一個樣品分析之前，用潔凈空氣吹掃10 min，以防止樣品氣味的殘留。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測結果均以平均值±標準偏差(Mean±SD，n=3)表示。采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行單因素分析(ANOVA)，所有差異分析均在p=0.05水平進行，電子鼻采用儀器工作站自帶的Alpha soft 14.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理時間的優(yōu)化

表2為雌蟹性腺0～30 min，100 ℃熱處理過程中的揮發(fā)性物質(zhì)鑒定結果，可以看出隨著熱處理時間的延長，揮發(fā)性物質(zhì)的種類呈不斷增加趨勢。生樣性

腺僅檢測出7種氣味物質(zhì)，而當熱處理時間達到25 min和30 min時，檢測的氣味物質(zhì)達到19種。由此可推斷熱處理時間為25 min以上時，其揮發(fā)性物質(zhì)能釋放完全。6種氣味物質(zhì)在30 min時被檢測的含量達到最高，其他氣味物質(zhì)的含量均在25 min時被檢測到有最高值，并且所有被檢測到的氣味物質(zhì)總含量均在25 min時達到最高。其中三甲胺、2-丁酮、3-甲基丁醛、戊醛、庚醛和苯甲醛在生樣中均未檢出，但在5 min開始檢出，被檢出的含量值在0～15 min呈現(xiàn)一定波動性，15～25 min之間各檢出物質(zhì)的含量呈逐漸增加趨勢。25 min之后有13種物質(zhì)含量有下降趨勢，這可能是由于已產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進一步降解為小分子物質(zhì)或者是與其他物質(zhì)發(fā)生了進一步反應[23]。

表2 雌性中華絨螯蟹性腺加熱0～30 min過程中揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定 單位：ng/g

注：1.N.D. 表示未檢出；2.同一行不同字母表示存在顯著性差異 (p<0.05)；下同。

雌蟹肝胰腺在100 ℃熱處理0～30 min過程中氣味物質(zhì)的變化如表3，肝胰腺生樣僅檢測出10種氣味物質(zhì)，隨著熱處理時間的延長，被檢測到氣味物質(zhì)種類依次增加，其中25 min時共檢測出23種氣味物質(zhì)，其中16種物質(zhì)含量達到最高值；而當熱處理時間為30 min時，檢測出22種氣味物質(zhì)，其中7種氣味物質(zhì)含量達到最高值，其他15種相對于25 min熱處理時均有下降，這與性腺結果相似，而2-(2-戊烯基)呋喃則未檢出，這可能是其發(fā)生了進一步降解；雌蟹肝胰腺經(jīng)不同時間的熱處理，揮發(fā)性物質(zhì)的含量波動較大，說明肝胰腺受溫度的影響要大于性腺，但總含量在25 min時達到最高。2-甲基-2-丁烯醛含量在15 min時達到最高，之后有明顯下降，這可能是由于15 min之后其降解速度大于生成速度。另外(E)-2-丁烯醛和2-戊基呋喃從10 min開始被檢出，2-甲基丁醛從20 min開始被檢出，(E)-2-庚烯醛從25 min開始被檢出。說明不同熱處理時間對不同揮發(fā)性化合物的生成和富集有顯著影響[24]。

表3 雌性中華絨螯蟹肝胰腺加熱0～30 min過程中揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定 單位：ng/g

揮發(fā)性化合物主要是一些小分子物質(zhì)，而脂質(zhì)和蛋白質(zhì)作為揮發(fā)性化合物的重要風味前體物質(zhì)[25-26]，其含量和組成對氣味物質(zhì)的形成有很重要的作用。吳娜[11]對雌性中華絨螯蟹的基本營養(yǎng)成分研究得出，雌蟹性腺中蛋白質(zhì)含量高于肝胰腺，而肝胰腺中的脂肪含量達40%，顯著高于性腺中的脂肪含量，說明肝胰腺具有高脂肪的特點。表2和表3的結果也顯示肝胰腺的整體氣味物質(zhì)要比性腺豐富，這可能與其高脂肪含量有關。綜合上述結果可以得出，熱處理時間為25 min時雌性中華絨螯蟹的氣味物質(zhì)種類最豐富。

2.2 雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理溫度的優(yōu)化

選擇上述優(yōu)化的熱處理時間條件，采用GC-MS對中華絨螯蟹性腺和肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質(zhì)進行測定，分別如表4和表5所示。

表4 雌性中華絨螯蟹性腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質(zhì)鑒定 單位：ng/g

續(xù)表4

保留時間/min化合物加熱溫度/℃6070809010016.839糠醛3.93±0.184.36±1.143.03±0.25N.D.N.D.23.013苯甲醛19.15±2.39a35.18±3.09b45.82±6.14b116.09±9.06c142.00±11.54d23.9462-戊基呋喃N.D.N.D.N.D.5.03±0.6938.06±5.8424.3692-(2-戊烯基)呋喃N.D.N.D.N.D.6.03±0.7910.20±2.3224.461辛醛27.99±1.18a27.22±2.75a36.64±2.90b41.94±5.48b51.71±6.00c24.965(E,E)-2,4-庚二烯醛N.D.N.D.N.D.N.D.12.29±0.0228.6152-壬酮1.00±0.48a3.63±1.04b3.63±0.21b4.43±0.20bc5.31±0.24c29.365壬醛17.94±3.06a23.71±4.30a36.26±3.54b34.46±2.40b98.83±3.26c總計118.86±19.58a170.82±15.80b253.79±15.93c337.61±10.97d506.32±8.57e

表5 雌性中華絨螯蟹肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質(zhì)鑒定 單位：ng/g

隨著溫度的升高，性腺中被檢出的氣味物質(zhì)逐漸增加，在60、70、80、90和100 ℃熱處理時，分別檢測出11、11、12、14和20種氣味物質(zhì)，其中三甲胺、1-戊烯-3-醇、戊醛、1-戊醇、甲苯、己醛、苯甲醛、辛醛、2-壬酮和壬醛在所設定溫度范圍內(nèi)都有被檢測到；其含量值總體呈現(xiàn)遞增趨勢，這可能是隨著熱處理溫度的升高，大分子物質(zhì)降解程度加劇的結果，并在100 ℃時其含量值達最大。所以此類物質(zhì)也將是之后脂質(zhì)熱氧化降解研究中應該要著重關注的。揮發(fā)性物質(zhì)的總含量在100 ℃時達到最高，且顯著高于其他溫度水平，其中3-甲基丁醛、1-戊烯-3-酮、2-乙基呋喃、2-甲基-2-丁烯醛、二甲基二硫化物和(E,E)-2,4-庚二烯醛僅在100℃熱處理時才被檢出，這表征性腺中這些物質(zhì)對熱處理溫度具有選擇性[24]。

雌性中華絨螯蟹肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量相對于性腺要更豐富，其中在60、70、80、90和100 ℃熱處理后分別檢測出14、15、21、25和25種物質(zhì)，除1-戊烯-3-醇、1-戊烯-3-酮、1-戊醇、甲苯和2-壬酮的含量在80 ℃時有下降趨勢之外，其他物質(zhì)含量都隨著熱處理溫度的上升呈現(xiàn)遞增趨勢，在100 ℃時含量達到最高，這和性腺結果相似。80 ℃時這幾種物質(zhì)的含量值逐漸下降，然而被檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)種類顯著增加，說明該溫度點對性腺氣味物質(zhì)影響較大[17]。己醛和戊醛由亞油酸鹽氫過氧化物的分解產(chǎn)生[23]，80 ℃時才被檢出，這也驗證了上述結果。而三甲胺、3-甲基丁醛、2-戊基呋喃和壬醛在設定溫度范圍內(nèi)都有被檢出，且含量隨溫度的上升而升高，100 ℃時含量達到最高。綜合上述結果，可以得出雌性中華絨螯蟹熱處理溫度和時間分別是100 ℃和25 min時其揮發(fā)性物質(zhì)含量和種類都最豐富，能夠使其達到最佳風味。

2.3 雌性中華絨螯蟹關鍵脂質(zhì)的熱氧化體系構建

國內(nèi)外學者的研究也已經(jīng)證實，醛類作為河蟹性腺和肝胰腺的主要香氣物質(zhì)，主要來自于脂質(zhì)和脂肪酸的熱降解[27]，而溫度、時間、水分、氧氣等作為脂質(zhì)氧化的關鍵因素，是本實驗熱氧化體系的構建主要考慮的4種因素。本實驗通過向關鍵脂質(zhì)中添加水分構建體外模型以還原蟹體原始脂質(zhì)與水分比例。結合實際蒸制條件，熱處理溫度和時間選擇100 ℃，25 min，通過電子鼻對關鍵脂質(zhì)的水分和氧氣條件進行優(yōu)化，構建完整的脂質(zhì)熱氧化體系。

2.3.1 雌蟹性腺中TG熱氧化體系的構建

圖1為添加不同水分梯度的TG在100 ℃, 25 min熱處理之后的PCA圖，第一和第二主成分方差貢獻率之和(PC1%+ PC2%)為98.73，區(qū)分指數(shù)(Discrimination index, DI)為85，說明其能夠反映樣本信息的完整程度，且不同樣品之間可以進行很好的區(qū)分[28]。其中第一主成分貢獻率最高(91.039%)，因此在PC1方向上當添加水分為6 μL和9 μL時其氣味輪廓與性腺樣品最為接近[29-30]。結合性腺樣品中的實際水分與TG比值，確定當6 μL 為TG的最終水分添加量，此時其氣味輪廓與性腺樣品最為接近。

圖1 河蟹性腺中的TG在添加不同水分后的PCA圖Fig.1 PCA results of TG in gonads added with differentcontents of water

在添加6 μL水分的基礎上，通過對真空和正常有氧條件下的TG進行熱處理，結合電子鼻雷達圖結果進行分析(圖2)，可以看出有氧條件下的TG對各個傳感器的響應值與性腺樣品最為接近，整體氣味輪廓與樣品最為相似。其中傳感器P30/2, T30/1, LY2/g CTL, LY2/GH, LY2/AA和LY2/G在真空條件下相對樣品其響應值均變小，因此這些傳感器所對應的敏感物質(zhì)類型[31]，如極性有機化合物、胺類化合物、氨、醛類、丙酮、碳氧化合物等是值得后續(xù)關注的。綜上所述，雌蟹性腺中的關鍵脂質(zhì)TG的最優(yōu)熱氧化體系條件是：100 ℃, 25 min, 水分6 μL,正常有氧條件。

圖2 河蟹性腺及TG有氧和真空條件下的雷達圖Fig.2 Radar results of TG in gonads under aerobic and vacuum conditions注：Ox, 有氧條件；Va, 真空條件；以下同。

2.3.2 雌蟹肝胰腺中PE熱氧化體系的構建

同樣地，雌蟹肝胰腺PE中水分的添加以15 μL為基礎設置梯度，分別為0、7.5、15和22.5 μL，電子鼻結果如圖3-a所示，PCA圖區(qū)分指數(shù)為79，第一主成分貢獻率達到99.094%， 說明不同樣品在PC1方向上可以達到良好區(qū)分。PCA圖顯示添加不同水分的PE的氣味輪廓與肝胰腺樣品相差較遠，相對來說添加水分為0和15 μL時，PE的氣味輪廓與肝胰腺樣品最為接近。通過進一步對添加0和15 μL水分的PE和肝胰腺樣品進行PCA分析發(fā)現(xiàn)(圖3-b)，添加水分為0時，在PC1方向上，其氣味輪廓與樣品更為接近。在此基礎上對氧氣條件進行驗證，雷達圖中對各個傳感器的響應值可知(圖4)，真空條件下的PE對各個傳感器幾乎無響應，而有氧條件下除LY2/g CTL, LY2/GH, LY2/AA和LY2/G外，PE對各個傳感器的響應值與肝胰腺樣品最為接近。根據(jù)傳感器響應值的高低，說明肝胰腺的主要氣味集中在這幾個傳感器所對應的敏感物質(zhì)上。綜合上述可知，雌蟹肝胰腺中PE的熱氧化體系條件為：100 ℃，25 min，水分0 μL，有氧條件。

圖3 河蟹肝胰腺中的PE在添加不同水分后的PCA圖Fig.3 PCA results of PE in hepatopancreas added with different contents of water

圖4 河蟹肝胰腺及PE有氧和真空條件下的雷達圖Fig.4 Radar results of PE in hepatopancreass under aerobic and vacuum conditions

3 結論與展望

MMSE結合GC-MS對雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理過程中關鍵揮發(fā)性物質(zhì)進行測定，根據(jù)關鍵揮發(fā)性物質(zhì)在熱處理過程中含量及種類的變化，最終確定熱處理時間和溫度。在此基礎上通過電子鼻結合PCA圖和雷達圖對關鍵脂質(zhì)的氣味輪廓與相應可食部位的氣味輪廓進行比較，對關鍵脂質(zhì)的水分添加以及有氧和真空進行優(yōu)化，最終確定,性腺中關鍵脂質(zhì)TG的熱氧化條件為：100 ℃，25 min，水分6 μL，有氧條件；肝胰腺中關鍵脂質(zhì)PE的熱氧化條件為：100 ℃，25 min，水分0 μL，有氧條件。本研究對關鍵脂質(zhì)進行熱氧化體系的構建，為脂質(zhì)分子種、脂肪酸以及揮發(fā)性物質(zhì)的測定提供反應條件，從而確定關鍵脂質(zhì)分子種，為脂質(zhì)熱氧化降解特性的研究提供基礎。