siRNA下調THBS4對人骨肉瘤MG63增殖的影響

謝冰穎 李生強 謝麗華 陳娟 葛繼榮

福建省中醫藥研究院基礎醫學研究所 骨質疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350003

血小板反應蛋白(Thrombospondin)是內質網產生的一類機體在受損、重建或重修飾的組織細胞中產生的蛋白，它能調控其他蛋白的表達，幫助糾正或清除錯誤折疊、無功能意義的蛋白。課題組前期的人骨組織芯片檢測中，我們發現骨質疏松癥患者股骨血小板反應蛋白4(Thrombospondin 4，THBS4)表達出現降低[1]，已有報道THBS4在心臟功能[2,3]、血管新生[4]、腫瘤[5]中起著重要作用，但其在成骨過程中的作用需要進一步研究。本研究采用siRNA敲低MG63細胞中THBS4的表達，觀察其對MG63細胞株成骨功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細胞株MG63購自武漢大學細胞庫。DMEM培養基購自美國Thermol，胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。鼠抗人Thbs4、兔抗β-actin以及兔抗TGF-beta1購自美國Thermol。Primer Script Rtreagent kit, Real time PCR kit 購自寶生物工程(大連)公司，THBS4-siRNA及陰性對照，轉染試劑均購自廣州市銳博生物科技有限公司。ECL試劑購自Thermol。多功能酶標儀(美國賽默飛Thermol)，實時熒光定量PCR儀ABI 7500fast(美國ABI公司),多功能成像工作站FluorChem M(美國Proteinsimple公司)。

1.2 細胞培養

MG63培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于5% CO2、37 ℃中傳代培養，并取對數生長期的細胞用于細胞轉染實驗。

1.3 siRNA瞬時轉染

轉染前24 h將細胞以每孔0.8×105的密度接種于24孔板中進行培養，待細胞處于對于生長期并且融合度達60%時進行轉染。分為實驗組，陰性對照組和空白組。前兩組分別轉染特異性Thbs4 siRNA和陰性對照siRNA，空白對照組細胞不做任何處理。轉染方法參照廠家說明書進行。實驗重復3次。轉染后48 h收集細胞用于定量PCR實驗，72 h收集細胞用于蛋白質印跡實驗。

1.4 CCK-8增殖實驗

在24孔培養板中進行細胞轉染，在細胞轉染后24、48、72、96 h，每孔分別加入2 μL CCK-8，放回CO2細胞培養箱中繼續孵育1 h，于多功能酶標儀上檢測450 nm吸光度。

1.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平

采用Trizol方法抽提總RNA后，逆轉錄過程按照SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit II試劑盒說明操作。以GAPDH為內參，并設3個重復管，進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系的反應步驟：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，40個循環，并增加熔解曲線程序，以觀察PCR產物是否單一。各基因引物序列，產物大小見表1。各樣品的目的基因和管家基因分別進行定量 PCR反應。mRNA相對表達量以2-△△Ct表示， △Ct=(Ct 目的基因 - Ct GAPDH)； 以對照組作為基線，采用以下公式計算目的基因 mRNA表達差異倍數(folds change)=2-△△Ct， 其中△△Ct=(Ct 目的基因-Ct GAPDH)實驗組 -(Ct目的基因- Ct GAPDH)對照組。

表1 定量PCR實驗引物序列Table 1 Sequences of primers for Real-time PCR

1.6 蛋白表達水平檢測

轉染72 h后，胰蛋白酶消化MG63細胞，收集細胞，置冰上采用細胞裂解液進行細胞裂解、提取總蛋白，以BCA法進行蛋白定量。上樣30μg/孔， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V濕轉60 min，含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2h，鼠抗THBS4(1∶400)、兔抗TGF-beta(1∶500)、兔抗β-actin(1∶1000)4℃孵育過夜。第二天，TBST洗滌10 min×3次后，羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育2 h，洗滌后Thermol ECL顯色，置入多功能成像工作站進行曝光記錄。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 MG63的鑒定

在相差顯微鏡下，人骨肉瘤細胞貼壁生長，細胞呈梭形。細胞轉染后，由于轉染試劑的毒性，有少量細胞死亡，大部分MG63仍呈梭形，見圖1。

2.2 THBS4 siRNA轉染后對細胞增殖的影響

在轉染后不同時間點，采用 CCK-8檢測3組吸光度值 (optical density，OD)，結果表明轉染后48 h，72 h，實驗組OD值高于陰性對照組(P<0.05)，差異具有顯著性。表明siRNA轉染后能促進骨肉瘤 MG63 增殖，見圖2。

圖2 CCK-8檢測不同階段對MG63細胞增殖的影響與陰性對照組相比，*P<0.05Fig.2 The proliferation of MG63 cells at different stages detected with CCK-8 Compared with negative control group,*P<0.05

2.3 THBS4 siRNA對 mRNA表達影響

Real-time PCR檢測結果顯示，siRNA轉染后，與陰性對照組相比，實驗組THBS4 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。陰性對照組與空白組比較差異無統計學意義。轉染后，實驗組TGF-beta1 mRNA表達水平顯著提高(P<0.01)，見圖3。

圖3 THBS4 siRNA對 MG63細胞mRNA表達影響與陰性對照組相比，**P<0.01Fig.3 Effect of THBS4 siRNA on the expression of mRNA in MG63 cells Compared with negative control group,**P<0.01

2.4 蛋白質印跡法檢測THBS4 siRNA轉染后蛋白表達

結果顯示， siRNA轉染后，與陰性對照組相比，實驗組THBS4 蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義。轉染后，實驗組TGF-beta1 蛋白表達水平顯著提高(P<0.01)，比陰性對照組提高1.7倍。

圖4 THBS4 siRNA對 MG63細胞蛋白表達影響與陰性對照組相比，**P<0.01Fig.4 Effect of THBS4 siRNA on the expression of proteins in MG63 cell Compared with negative control group,**P<0.01

3 討論

血小板反應蛋白家族(Thrombospondins family, THBS)是一組進化保守的，可以短暫的或長期的與細胞外其他間質發生作用，需要鈣結合的細胞外間質蛋白，參與眾多生物過程，發揮包括細胞間橋接，細胞與基質的相互作用[2]。目前發現的—共有5個成員，分別是THBS1、THBS2、THBS3、THBS4和THBS5[6]。

THBS4是一種分泌型蛋白，最早由Lawler J[7]于1993年發現。THBS4有明顯的組織表達差異性，在心臟、骨骼肌及肌腱[8]中大量表達。它能與膠原和非膠原結合，可以調控細胞遷移、細胞增殖、連接、粘附、血管生成、神經發育、組織架構、器官發育，在疼痛信號傳導和腫瘤[9-11]的發生發展中起到重要作用。近年來，THBS4在腫瘤中的研究越來越多，它在胃癌[12,13]、前列腺癌中[14]高表達，具有識別腫瘤生物學特性的潛能并可能用于臨床腫瘤早期診斷和預后判斷。課題組前期的人骨組織芯片檢測中，骨質疏松癥患者股骨THBS4表達下調[1]。在本研究中，THBS4特異性siRNA可以顯著降低THBS4的mRNA及蛋白表達，CCK-8實驗表明對細胞增殖具有促進作用。

轉化生長因子β(TGF-β)是骨組織中重要的細胞因子[15]，廣泛存在于正常組織及轉化細胞中，以骨組織和血小板中的含量最為豐富，TGF-β有5 種異構體，即TGF-β1-5，其中最早發現和研究最充分的是TGF-β1。研究證實[16]，TGF-β1 能促進成骨細胞增殖、分化，刺激細胞外基質合成，同時還能降低骨轉換，促進骨與軟骨的形成，加快破骨細胞的凋亡。TGF-β對骨的生長發育及重建都有重要的調節功能，是參與調節骨重建最重要、最基本的細胞因子之一[17]。Muppala S 等發現THBS4參與了TGF-β1誘導的血管新生，說明THBS4能夠參與TGF-β1信號通路[18]。本實驗中，實驗組采用siRNA敲低THBS4后，TGF-β1能顯著提高，表明敲低THBS4后可以激活TGF-β1信號通路。考慮到TGF-β對骨的生長發育的重要性，敲低THBS4可能提高MG63成骨能力。后期實驗可檢測成骨過程中的關鍵基因、蛋白的變化，證實對成骨的影響。

THBS4作用機制比較復雜，也存在著對立的報道。在腫瘤的研究中，多種腫瘤研究數據顯示THBS4過表達，至少在轉錄水平上存在差異。多數數據支持可能起到刺激腫瘤細胞增殖，有利于腫瘤細胞浸潤和轉移的作用，但也有數據顯示可能發揮著抑癌基因的作用[11]。在最近的報道中，Anke J[19]等發現基因敲除小鼠THBS4并沒有影響骨骼的生長，但會引起短暫的軟骨厚度減少。這與本文的結果有些不一致。分析原因，可能是基因發揮生物學功能不但取決于細胞類型、細胞內環境，還受到激素的控制[20]。THBS4在骨組織中的功能，尤其在軟骨發育中的作用還需要進一步研究。