結核感染T細胞斑點試驗在結核性漿膜炎中的診斷價值研究*

傅滿姣，吳佳玲，貝承麗，翟安，楊芬，王慧，曹士鵬，葉江英

（湖南省長沙市中心醫院，湖南 長沙 410004）

結核性漿膜炎是最常見的肺外結核，目前結核性漿膜炎診斷的金標準是結核桿菌培養陽性、組織病理活檢證實為結核干酪樣壞死[1-2]。但結核桿菌培養耗時長且陽性率低，而活檢是有創檢查，部分患者無法耐受。而結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test,TST）、漿膜腔積液常規生化、結核桿菌脫氧核糖核酸（tuberculosis deoxyribonucleic acid, TB-DNA）檢測等常規臨床檢測方法又存在敏感性和特異性低的問題，因此急需一項簡便耗時短、敏感性及特異性均高的結核性漿膜炎診斷方法。近年來，外周血γ－干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assays, IGRAs）已成為診斷結核感染的常用方法，其診斷結核的特異性明顯高于TST[3]。有研究顯示，來自結核感染部位的體液樣本，其中單核細胞數量高于外周血單核細胞數量[4-5]。因此筆者推測漿膜腔積液結核感染T細胞斑點試驗（tuberculosis infection T cell spot test,T-SPOT.TB）檢測可以大大提高結核性漿膜炎的早期診斷率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月-2016年3月湖南省長沙市中心醫院住院收治的結核性漿膜腔積液患者102例作為結核組。其中，男性69例，女性33例；年齡18～75歲；結核性胸膜炎54例，結核性腹膜炎28例，結核性心包炎20例；92例有發熱；患者結核確診41例，臨床診斷61例；經抗結核治療96例明顯好轉，4例放棄治療，1例合并重癥肺炎并放棄治療，2例合并腎衰，2例結核性心包炎，另有1例合并全身多器官結核死亡。納入標準：①患者病史采集、體格檢查、胸部影像學檢查（胸部CT、X射線）、TST、漿膜腔積液常規檢查、漿膜腔積液生化檢查、T-SPOT.TB、TBDNA、患者痰和漿膜腔積液抗酸涂片染色及結核分枝桿菌培養等資料齊全。②漿膜腔積液結核分枝桿菌抗酸染色涂片培養陽性，或有典型的組織病理學改變（干酪樣壞死、上皮樣肉芽腫改變等），且有臨床癥狀、體格檢查及影像學表現支持，定義為結核確診患者；患者臨床表現、體格檢查、實驗室檢查（漿膜腔積液常規、生化）及胸部影像學表現符合結核性漿膜炎，且診斷性抗結核治療有效，定義為結核臨床診斷患者。排除標準：患有HIV感染、嚴重營養不良、惡病質、麻疹及水痘。選取同期本院收治的非結核性漿膜腔積液患者50例作為非結核組。其中，男性35例，女性15例；年齡28～78歲；腫瘤轉移至胸膜25例，膿胸5例，自發性腹膜炎3例，腫瘤轉移至腹膜11例，心力衰竭致心包積液2例，腫瘤轉移至心包4例，腫瘤患者逐漸惡化，心力衰竭患者好轉。納入標準：①患者病史采集、體格檢查、胸部影像學檢查（胸部CT、X射線）、TST、漿膜腔積液常規檢查、胸膜腔積液生化檢查、T-SPOT.TB、TB-DNA、患者痰和漿膜腔積液抗酸涂片染色及結核分枝桿菌培養等資料齊全；②痰、漿膜腔積液涂片抗酸染色、結核培養或組織病理學結果為陰性，無結核接觸史及陳舊性結核病史，并可以明確診斷為其他疾病，針對原發疾病治療有效果[4]。排除標準：患有HIV感染、嚴重營養不良、惡病質、麻疹及水痘。兩組患者的年齡、性別、激素及免疫抑制劑使用、既往結核病史及基礎疾病比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

患者入院后取新鮮漿膜腔積液約50 ml，在漿膜腔積液標本采集后2 h內送本院檢驗實驗室，在4h內完成T-SPOT.TB、腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）、TB-DNA及結核桿菌培養檢測。

1.2.1 T-SPOT.TB 本研究采用T-SPOT.TB試劑盒（英國Oxford Immunotec公司）。將漿膜腔積液患者的標本分離得到單個核細胞，并馬上制備成細胞濃度為2.5×106/ml的細胞懸液。將相對應的細胞培養液作為陰性對照，取植物血凝素作為相應的陽性對照，采用結核桿菌特異性抗原-早期分泌抗原靶蛋白（6kD early secreting antigenictarget-6, ESAT-6）和培養濾液蛋白10（culture filtrateprotein10KD, CFP-10）作為刺激抗原。在檢測板的每個孔內加入抗原和單個核細胞，將微孔板放在含5%二氧化碳CO2的培養箱中培養18～20 h；48 h后洗板，并加入生物素標記的相應二抗，放置于2～8℃的環境中反應1 h，再次洗板并加入顯色底物液，在室溫下靜置約7 min后用去離子水終止顯色反應。上機檢測斑點形成細胞數。ESAT-6和CFP-10的斑點數任一項＞50SFCs/106SEMC定義為陽性。

1.2.2 漿膜腔積液上清ADA的檢測 采用加入EDTA抗凝劑的玻璃瓶收集漿膜腔積液10 ml，3 000 r/min離心5 min，取漿膜腔積液上清，并用用酶比法（寧波美康生物科技有限公司提供試劑盒）檢測上清液中ADA的相應含量，ADA＞45 u/L定義為陽性。

1.2.3 TB-DNA檢測 采用結核桿菌特異性引物、特異性熒光探針，混合PCR的反應液、Tap酶、核苷酸單體，采用PCR體外擴增法（廣州市中山大學達安基因有限公司提供試劑盒）檢測結核桿菌DNA。

1.2.4 結核分枝桿菌培養檢測 采用液體培養基及BACTEC-TB 960法進行漿膜腔積液的分枝桿菌快速培養，取5 ml漿膜腔積液于無菌試管中送檢，根據說明書進行操作。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計學軟件，計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC曲線，計算敏感性、特異性、Youden指數、陽性預測值及陰性預測值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漿膜腔積液T-SPOT.TB患者診斷結核性漿膜腔炎的ROC曲線

將152例漿膜腔積液T-SPOT.TB患者檢測結果繪制成ROC曲線，曲線下面積為0.893（95%CI：0.834，0.952），漿膜腔積液中T-SPOT.TB的最佳診斷閾值（cutoff值）為斑點數108.5SFCs/106SEMC（Youden指數最高）。見圖1。

2.2 不同漿膜腔炎中T-SPOT.TB的敏感性比較

圖1 漿膜腔積液T-SPOT.TB診斷結核性漿膜腔炎的ROC曲線

T-SPOT.TB診斷結核性胸膜炎、結核性腹膜炎及結核性心包炎的敏感性分別為92.6%、89.3%和80.0%，經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=2.688，P=0.268）。

2.3 各檢測指標敏感性、特異性、Youden指數、陽性及陰性預測值比較

T-SPOT.TB分別與ADA、TB-DNA、結核分枝桿菌培養的敏感性和特異性比較，差異有統計學意義（χ2=4.867、6.069和 3.911，P=0.027、0.014和 0.048）。T-SPOT.TB的Youden指數高于ADA、TB-DNA及結核分枝桿菌。T-SPOT.TB的陽性預測值高于ADA及TB-DNA，僅低于結核分枝桿菌培養。T-SPOT.TB的陰性預測值高于ADA、TB-DNA及結核分枝桿菌。見附表和圖1～4。

附表 各檢測指標敏感性、特異性、Youden指數、陽性及陰性預測值比較

圖3 漿膜腔積液TB-DNA診斷結核性漿膜腔炎的ROC曲線

圖4 漿膜腔積液結核分枝桿菌培養診斷結核性漿膜腔炎的ROC曲線

3 討論

漿膜腔積液在臨床實際工作中多見，病因有：結核、惡性腫瘤原發和轉移、非結核感染、肝硬化、腎病及心功能不全等，結核性漿膜腔積液在我國較多見。結核性漿膜腔積液早期臨床癥狀不典型，難以根據臨床表現、積液的常規生化早期診斷。T-SPOT.TB檢測中納入結核分枝桿菌特異抗原，即ESAT-6和CFP-10，由RD1區編碼[5-7]。該區只存在于結核分枝桿菌復合群和少數致病性非結核分枝桿菌基因組中，用ESAT-6和CFP-10作為結核分枝桿菌感染的特異性T細胞刺激抗原，通過酶聯免疫斑點試驗檢測受試者體內是否存在結核效應T細胞，從而判斷受試者是否感染結核分枝桿菌。本研究中，行漿膜腔積液T-SPOT.TB檢測可以獲得較高的敏感性、特異性、Youden指數、陽性及陰性預測值。且本研究所獲得的T-SPOT.TB敏感性值與之前報道大體一致[8-12]。本研究中，結核性胸膜炎的敏感性為92.6%，結核性腹膜炎的敏感性為89.3%，結核性心包炎的敏感性為80.0%，T-SPOT.TB診斷結核性胸膜炎敏感性高，可能與結核性胸膜炎較其它漿膜炎多見有關。3者的TSPOT.TB敏感性均＞80%，提示漿膜腔的TSPOT.TB檢測對診斷結核性胸膜炎、腹膜炎及心包炎均有一定臨床價值。

本研究得出漿膜腔積液T-SPOT.TB的敏感性88.2%和特異性86.0%，與張麗帆等[6]報道的漿膜腔積液T-SPOT.TB的靈敏度性91.9%和特異性87.1%相似。本研究中漿膜腔積液的ADA敏感性低于T-SPOT.TB，敏感性僅為45.2%，說明ADA與T-SPOT.TB相比，難以檢測到結核性胸膜炎的發生。漿膜腔積液TB-DNA的敏感性在本研究中僅為9.8%，與萬榮等[13]觀察的150例結核性胸膜炎中的TB-DNA診斷敏感性7.4%相似。但TRAJMAN等[14]研究發現：TB-DNA診斷結核性胸膜炎的敏感性為35%～82%，特異性為85.4%～100%，高于本研究敏感性數值，考慮與選擇患者病情嚴重程度、肺結核是否接近胸膜有關。TB-DNA特異性在本研究中為98%，與TRAJMAN等[14]的研究結果相近。本研究中結核分枝桿菌培養敏感性為18.6%，特異性為100%，與陳希等[15]所報道的93例胸腔積液的結核培養靈敏度性（14.6%）和特異度（100%）相似。這充分說明，漿膜腔積液的結核培養作為結核診斷的金標準，具有相當高的特異性，但是結核培養周期長、假陰性率高，嚴重地制約了結核桿菌培養在臨床上的應用。

本研究中T-SPOT.TB的陰性預測值高于其他預測指標，提示T-SPOT.TB診斷結核性漿膜積液的假陰性率低，T-SPOT.TB檢測結果陰性表示罹患結核的可能性非常小，對于排除結核性漿膜炎更有臨床診斷價值。本研究中T-SPOT.TB檢測出現7例假陽性，其中肺癌轉移患者5例，卵巢癌轉移患者1例，乳腺癌轉移患者1例，這可能與腫瘤患者免疫力低下，取漿膜腔積液樣本時正處于結核潛伏感染期或者為陳舊性肺結核患者。在臨床實際工作中，曾出現痰涂片陽性，但T-SPOT.TB檢測陰性的情況，這也可能與目前結核輔助篩查手段胸部CT難以發現微小的胸部結核病灶相關[16]。因此T-SPOT.TB檢測陽性，必須要結合結核相關臨床表現及相關輔助檢查綜合判斷，指導患者的診療。本研究也出現假陰性的情況，原因可能與在采漿膜腔積液樣本時，雖有結核桿菌感染，但體內的T細胞未致敏，或者當患者合并HIV等免疫缺陷疾病時，機體難以對結核桿菌產生應有的免疫應答，因此當T-SPOT.TB檢測結果陰性時，也不能單憑這一結果否定結核的診斷，而應當考慮患者的臨床表現、其他輔助檢查結果，綜合評判。NEMETH等[17]認為，結核桿菌感染的部位具有隔室化的特點，即機體免疫系統中大量T淋巴細胞、B淋巴細胞被募集到結核感染部位，并且分泌大量的細胞因子從而發揮對結核桿菌的免疫應答。本研究中漿膜腔積液T-SPOT.TB檢測陽性率較高，T細胞敏感性高，也支持該結論。隨著醫學生物技術的發展，T-SPOT.TB檢測技術樣本已經不再局限于外周血標本，胸水、腹水、纖維支氣管鏡下支氣管肺泡灌洗液、痰液及心包穿刺液等已嘗試用于結核檢測。

目前，有研究者嘗試用結核性腦脊液進行T-SPOT.TB檢測，但是因腦脊液中T細胞數太少，難以檢測。目前胸水用于T-SPOT.TB檢測的研究較為深入，本研究發現T-SPOT.TB檢測結核性胸腔積液具有較高的敏感性和特異性，同時發現除了用于檢測結核性胸膜炎，T-SPOT.TB檢測用于結核性腹膜炎、心包炎同樣具有較高的敏感性、特異性、陽性和陰性預測值，對早期診斷結核性胸腔積液有較高的臨床診斷價值。