高效液相色譜法測定傷口護理產品中次沒食子酸鉍含量

北京市醫療器械檢驗所（101111）王利霞 崔永平 黃永富 岳衛華

次沒食子酸鉍具有收斂、防腐的功效，外用于濕疹等皮膚病。此外，臨床上還經常用于治療胃潰瘍，鉍制劑在胃潰瘍的治療中有其獨特的優勢，它可以直接殺滅幽門螺桿菌，克服幽門螺桿菌對抗生素的原發耐藥和避免繼發耐藥，對胃黏膜有保護作用[1]。此外，次沒食子酸鉍常作為一種有效成分添加在傷口護理軟膏、傷口敷料等醫療器械產品中，應用于燒傷傷口表面的處理，內外痔瘡的炎癥及出血癥狀的治療。常見的產品代表有：復方次沒食子酸鉍栓、傷口護理軟膏、傷口敷料等等。這些產品的技術要求或注冊產品標準中對次沒食子酸鉍的含量都有明確的規定，因此建立一種準確快速測定次沒食子酸鉍含量的方法，對該類醫療器械產品的質量控制十分必要。目前尚未見次沒食子酸鉍含量測定的相關報道，但應用高效液相色譜法對其原料沒食子酸的含量測定有一些報道[2-5]，研究對象多為各類中藥材中的沒食子酸含量。本研究采用HPLC法測定傷口護理產品類醫療器械中的次沒食子酸鉍含量，為該類產品的質量控制提供檢測依據。次沒食子酸鉍的合成：用沒食子酸和硝酸鉍進行反應，生成次沒食子酸鉍，經沉淀、過濾、洗滌、干燥后得到次沒食子酸鉍，見附圖1。

附圖1 次沒食子酸鉍合成路線

附圖2 次沒食子酸鉍標準品色譜圖

1 材料和方法

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備紫外檢測器；電子天平（梅特勒-托利多公司）；次沒食子酸鉍對照品，純度：49.1%（以三氧化二鉍計），甲醇（色譜級，Fisher）；磷酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20101115）；氯仿（分析純，北京化工廠，批號：20160902），鹽酸（優級純，北京化工廠，批號：20160508），水為milli Q純化水。昆山市超聲儀器有限公司超聲波清洗儀，傷口護理產品（由醫療器械生產廠家提供）；傷口敷料（由醫療器械生產廠家提供）。

1.1 儀器分析條件 用Agilent 1260高效液相色譜儀進行檢測，色譜柱：SunFireTMC18分析柱，（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：254nm；流動相：甲醇：0.05%（v/v）磷酸=15∶85（v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：25μL。理論塔板數以次沒食子酸鉍計應不小于2000，保留時間為5.5min，次沒食子酸鉍色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5。

1.2 對照品溶液的制備 精密稱取次沒食子酸鉍對照品45mg，置于燒杯中，加入10mL 6N的鹽酸，超聲處理，直至次沒食子酸鉍完全溶解，轉移至100mL容量瓶，用0.06N鹽酸定容至刻度，即得450μg/mL次沒食子酸鉍標準溶液儲備液。取儲備液適量用0.06N鹽酸逐級稀釋，得到濃度為2.25μg/mL、4.5μg/mL、18μg/mL、27μg/mL和45μg/mL一系列標準溶液。

1.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品（1.0g±0.1）g，置于燒杯中，加20mL氯仿，振搖，直至樣品完全溶解，轉移至100mL分液漏斗中，然后加入10mL 6N鹽酸，振搖2min，靜置10min后進行分液，繼續用0.06N鹽酸反復萃取3次，合并上層濾液至100mL容量瓶，用0.06N鹽酸定容至刻度。即得樣品儲備液。取5mL樣品儲備液置于50mL容量瓶，用0.06N鹽酸稀釋至刻度并混勻，即得供試品溶液。

2 方法學考察

2.1 系統適用性 按“1.1”項下的色譜條件，理論塔板數按次沒食子酸鉍峰計算約為15819，不低于2000。拖尾因子1.01，表明峰對稱性良好。目標峰前后均無干擾峰。色譜圖見附圖2。

2.2 線性范圍和檢出限 取1.2項下配制的次沒食子酸鉍標準溶液，按照1.1中色譜條件進行測定，得到各濃度的峰面積值，見附表1。以峰面積值（Y）為縱坐標，次沒食子酸鉍濃度（X）為橫坐標，繪制次沒食子酸鉍標準曲線并得到線性回歸方程為y=18.56x-15.09；R=0.9994，見附圖3。該結果表明在2.25～46.95μg/mL范圍內線性關系良好。當稀釋對照品溶液濃度至0.09μg/mL時，其信噪比（S/N）等于3.0，故檢出限約為0.09μg/mL（S/N=3.0）。

附表1 次沒食子酸鉍標準溶液濃度對應峰面積值

2.3 精密度試驗 取濃度為45μg/mL標準溶液，按“1.1”項下的色譜條件連續進樣7次，記錄色譜圖，得到其峰面積，計算變異系數為0.51%。符合中國藥典2015年版規定的高效液相色譜外標法精密度要求（RSD不大于2%）[6]。表明方法精密度良好。

2.4 重復性 配制同一濃度的對照品溶液5份，按“1.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.64%（n=5）。

2.5 加樣回收率實驗 取已知濃度的樣品溶液9份，分別加入0.45μg/mL、4.5μg/mL、27μg/mL三種濃度的標準溶液，每個濃度平行測試3份，記錄色譜峰面積，低、中、高濃度的平均回收率均在93.3%～104.4%，總平均回收率為98.2%，相對標準偏差為3.3%（n=9）。表明回收率良好。結果見附表2。

2.6 穩定性試驗 取“1.2”項下的同一標準溶液，室溫放置0h、2h、4h、8h和24h，48h分別按“1.1”項下的色譜條件連續進樣分析，記錄峰面積，計算次沒食子酸鉍峰面積的RSD為0.9%。該結果表明次沒食子酸鉍在0.1N鹽酸水溶液中室溫放置至少48h內穩定。

2.7 樣品測定結果 用外標法測定了三種傷口護理產品中的次沒食子酸鉍含量，結果均滿足產品技術要求的規定。

3 討論

次沒食子酸鉍在水、乙醇、乙醚或氯仿中幾乎不溶，僅溶于熱的礦酸。本次檢測用于傷口護理的樣品中除了含有次沒食子酸鉍外，其余大部分是凡士林，根據這兩種物質的溶解特性，結合次沒食子酸鉍對照品的溶解性能，選擇了用鹽酸水溶液跟氯仿萃取的形式，分離樣品中的次沒食子酸鉍，本文對加入鹽酸溶液的量、振搖時間、靜置時間都經過優化，最終確定加入20mL氯仿分散樣品，先用6N鹽酸溶液10mL進行萃取，然后每次加入0.06N鹽酸溶液10mL，萃取三次，以充分提取樣品中的次沒食子酸鉍。

本研究的結果證明，高效液相色譜法（HPLC）在2.25μg/mL～45μg/mL較寬的次沒食子酸鉍濃度范圍保持良好的線性關系。不同類醫療器械產品中，次沒食子酸鉍含量相差較大，HPLC標準曲線較寬的線性范圍則能很好的適應產品特點，有利于確保檢測的可靠性。同時精密度和回收率試驗也表明此方法準確度高，精密度好，可以滿足日常檢測傷口護理產品中次沒食子酸鉍含量的要求，且操作簡單，分析速度快，易于推廣。