二陳湯對COPD模型大鼠肺組織AQP5基因表達的影響及意義※

張 淼 梁娟娟 王晨晨 臧丹陽 馮世雄 尚立芝王 祎

（河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的定義是一種常見的以持續(xù)性呼吸道癥狀氣流受限為特征的常見疾病[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示COPD患病風(fēng)險與年齡呈正相關(guān)[3]。臨床以咳嗽、咳痰、喘息、胸悶為主要癥狀，其中咳嗽、咳痰氣道黏液的分泌有關(guān)，二者屬中醫(yī)“咳嗽”“痰飲”的范疇[4-5]。二陳湯載于《太平惠民和劑局方》 （宋代），有和中理氣之功效。前期動物實驗研究表明二陳湯加味可改善COPD大鼠肺功能和氣道組織結(jié)構(gòu)[6]。但二陳湯的作用機制仍不清楚。本課題針對二陳湯對COPD大鼠AQP5基因表達的影響及其意義，更進一步研究中醫(yī)藥治療慢性阻塞性肺疾病的機制。

1 材料

1.1 動物 7～8周齡，SPF級，雄性Wistar大鼠50只 (山東魯抗醫(yī)藥有限公司，合格證號SCXK魯20130001)。

1.2 藥物與試劑 二陳湯水煎劑組成：陳皮10 g(批號1502001H)，茯苓15 g(批號1509001H)，姜半夏10 g(批號1503001s)，甘草6 g(批號1502001S)均選三九醫(yī)藥生產(chǎn)的中藥配方顆粒。脂多糖 (LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號701C036)。紅旗渠香煙 (河南安陽廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支)。羊抗大鼠AQP5一抗（批號287487），濃縮型兔IgG二抗（批號12I08A）、DAB試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 (批號分別為12I12B22、P0010)以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。內(nèi)參GAPDH抗體（Abcam公司，批號ab50838），總RNA提取Kit(批號086001），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Kit(批號119041），染料法qPCR試劑 (批號112141)，Oligo合成（批號D12540） 均為南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 inspira型小動物用呼吸機 (日本光電公司)，Top Scan型小動物肺功能測量系統(tǒng) (吉安德爾科技有限公司)，TP1020型全自動組織處理機，TP1020-1型自動組織脫水處理機，EG1150C型冷臺；ABL80型血氣分析儀 (丹麥Radiometer公司)；EG1150型自動包埋機，2370/06-2011半自動輪轉(zhuǎn)式切片機，DB-B1烤片機，H11210型攤片機，ST5020型全自動染色機 (德國徠卡公司)，20486顯微攝像儀，U-CMAD3型顯微鏡，BX51+CCD病理圖像分析系統(tǒng) (日本 Olympus公司)；Motic數(shù)字切片掃描系統(tǒng) (香港 MOTIC公司)，DU60型紫外分光光度計 (美國BECKMAN)，DHP-260型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (金壇市白塔新寶儀器廠)，G8OW23YSLP-E5實驗室用可調(diào)溫微波爐 (廣東格蘭仕集團有限公司)，XH-C旋渦混合器 (常州市國旺儀器制造有限公司)，DHP-260型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (金壇市白塔新寶儀器廠)，BSA124S-CW萬分之一電子天平 (德國賽多利斯集團)，ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城分析儀器制造有限公司)，BCD-206YH海爾冰箱 (青島海爾股份有限)，18號靜脈導(dǎo)管針 (馬來西亞制造)，課題組自制有機玻璃熏煙箱 (50 cm×50 cm×70 cm)。Multiskan MK3型酶標(biāo)儀 (美國Thermo Scintific公司)，Xcell Surelock型蛋白電泳槽 (美國Life technologies公司)，Mini-P R OTEAN Tetra C型轉(zhuǎn)移電泳槽 (美國Bio-R ad公司)，272007028實時熒光定量PCR儀（美國愛普拜斯Applied Biosystem)及其檢測軟件StepOne Software v2.1等均由河南中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研實驗室提供。

2 方法

2.1 分組 將50只大鼠隨機分5組分別為：正常對照組、COPD模型組、二陳湯顆粒沖劑低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 模型制備 采用香煙煙熏4周加氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)2次的復(fù)合因素復(fù)制COPD大鼠模型[7-8]。正常對照組在不干預(yù)的條件下正常飼養(yǎng)，在實驗第1、14日腹腔麻醉以1%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg），大鼠仰臥位在固定板上固定氣管，以靜脈導(dǎo)管針將200 μL LPS（每升生理鹽水含LPS 1 g）緩慢注入氣管，防止窒息。注射完畢后立即豎起固定板旋轉(zhuǎn)10～20 s，使其在兩肺均勻分布。在實驗第2～13日，15～28日，使大鼠在熏箱中每天吸入紅旗渠香煙煙霧（每次12支每天2次）。

2.3 給藥 參考文獻[9-10]二陳湯低、中、高劑量組分別給予二陳湯2.5、5、10 g·kg，用生理鹽水稀釋成6 mL灌胃。正常組及模型組給予同等劑量3 mL/d的生理鹽水灌胃；2次/d，連續(xù)灌胃14 d。

2.4 肺功能的測定 肺功能檢查在COPD的鑒別診斷中起到重要作用[11-12]，分別檢測潮氣量（TV），呼吸峰流速（PEF） 和50%潮氣量呼吸流量（EF50）。

2.5 取材、標(biāo)本制備與指標(biāo)觀測 深度麻醉大鼠后腹主動脈取血處死，取左肺制備肺組織勻漿液，取右肺組織4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，經(jīng)蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

2.6 RT-q PCR檢測AQP5 m RNA表達 制備10%的肺勻漿液，3000 rpm，4 ℃，離心5 min后，棄上清于無菌EP管中，-80℃冰箱儲存。提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增后進行RT-q PCR反應(yīng)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為AQP5：F：5'-CGTGTTCGCAGAGTTCCTG-3'，R：5'-CACAAGCGTCTCAAGGAC-3'；GAPDH：F：5'-GTG-GGCCGCCCCAGGCACCA-3'，R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACCATTTC-3'。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃延伸30 s，20～28個cycle。采用 2-△△CT法測量基因表達結(jié)果，計算目的基因相對于GAPDH基因的表達量。

2.7 蛋白免疫印跡法（Western blotting） 檢測肺組織AQP5蛋白的表達 取肺組織50 mg，加組織裂解液，冰浴下研磨，離心后收集上清液，提取總蛋白，BAC試劑盒進行蛋白定量。配制10%分離膠、5%濃縮膠，加入樣品，先以80 V恒壓電泳，后轉(zhuǎn)為110 V恒壓電泳，待蛋白充分分離后，電泳結(jié)束；200 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，封閉3 h，用TBST洗膜3次，每次5 min，分別加入抗AQP5一抗（稀釋1∶1 000） 和抗 GAPDH一抗 （稀釋1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，用含有5%BSA的TBST液稀釋二抗。加入二抗（1∶5000），室溫孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色。采用全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參β-actin的相對表達量。

2.8 免疫組化檢測 用SP法檢測肺水通道蛋白5的表達。常規(guī)石蠟4 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，3%H2O2封閉，微波熱抗原修復(fù)，兔抗鼠AQP5（稀釋1∶1000） 一抗，4°C過夜，滴加羊抗兔二抗，滴加SABC后再用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。免疫組化結(jié)果采用BX51+CCD病理圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）描述，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況 正常組大鼠未發(fā)現(xiàn)異常狀況。模型組大鼠毛黃無光，體重減輕，呼吸急促、咳嗽。治療組上述癥狀均有不同程度的改善。除正常組死亡1只外，其他各組均死亡2只大鼠。

3.2 各組肺功能比較 與正常組比較，模型組大鼠FVC、FEV1，以及FEV1/FVC均顯著變小（P＜0.05）；與模型組比較，二陳湯高、中劑量FVC、FEV1，F(xiàn)EV1/FVC均不同程度增大（P＜0.05），見表1。

表1 二陳湯對各組大鼠肺功能的影響 （x±s）

3.3 各組肺組織結(jié)構(gòu)改變 正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺內(nèi)細支氣管及肺泡腔內(nèi)無滲出物。模型組肺內(nèi)細支氣管腔內(nèi)積膿，細支氣管管壁上皮局部脫落。肺泡間質(zhì)增厚，炎細胞浸潤明顯，局部肺氣腫形成。二陳湯低、高劑量組略輕于模型組。二陳湯中劑量組炎癥明顯減輕。

圖1 各組肺組織結(jié)構(gòu)改變 （HE，×200）

3.4 各組肺組織水通道蛋白5 m RNA及蛋白表達 與對照組相比，模型組大鼠肺組織中AQP5的mRNA（P＜0.01） 和蛋白（P＜0.05） 表達均明顯減少。與模型組比較，二陳湯高、中劑量組AQP5的mRNA和蛋白表達顯著增高 （P＜0.05）。

表2 二陳湯對COPD大鼠各組肺組織中AQP5 mRNA及蛋白表達的影響 （x±s）

3.5 各組AQP5免疫組化結(jié)果 AQP5陽性顯色以肺泡Ⅰ型上皮細胞胞漿和膜呈棕黃色表達，肺泡Ⅱ型上皮細胞陰性（圖2）。與正常組相比，模型組大鼠肺組織中AQP5蛋白的表達顯著減弱（P＜0.01）。與模型組相比，二陳湯高、中劑量組AQP5蛋白的表達明顯增加（P＜0.05）。見表2。

圖2 各組AQP5免疫組化結(jié)果 （HE，×200）

4 討論

COPD是不完全可逆氣流受限的慢性肺部疾病，與機體對有害氣體及有害顆粒的異常反應(yīng)有關(guān)。主要危險因素包括：吸煙、燃燒生物燃料、空氣污染、呼吸道感染及其他宿主因素。COPD的發(fā)病機制目前不清，外界因素激活炎癥介質(zhì)后，導(dǎo)致中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞數(shù)增加，所以其持續(xù)性的炎癥反應(yīng)是出現(xiàn)咳嗽、咳痰等癥狀的關(guān)鍵[14-16]。

中醫(yī)辨證認為肺臟感邪，遷延久治，痰瘀稽留，其病理變化為本虛標(biāo)實[15]。肺為其標(biāo)，脾腎為本，痰飲之證，重在化痰理氣。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由陳皮、茯苓、半夏、甘草四味中藥組成。陳皮理氣行滯、燥濕化痰為君藥，半夏增強燥濕化痰之力為臣藥，佐以茯苓健脾滲濕，甘草健脾調(diào)和諸藥，四藥一方達到燥濕化痰，理氣和中之效。

水蛋白通道（AQP）是水分子跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白家族，廣泛分布于上皮組織細胞膜。氣道和肺內(nèi)分布的AQP參與調(diào)節(jié)氣道和肺內(nèi)的濕度。AQP表達下降可使氣道和肺內(nèi)濕度減弱，黏液變得黏稠而不易清除，引發(fā)上皮細胞的干燥及損傷，利于細菌大量繁殖而引起感染，而繼發(fā)炎癥。致使炎癥細胞滲出并釋放炎性介質(zhì)如白三烯、組胺、前列腺素等，使支氣管收縮，增加氣道阻力，減弱肺功能。AQP5作為肺組織中主要水通道蛋白，在氣道及肺內(nèi)液體的吸收及轉(zhuǎn)運方面具有重要的作用，與氣道黏液的分泌與調(diào)節(jié)有密切關(guān)系[17]。AQP5參與COPD患者氣流受限的形成和發(fā)展過程：AQP5的減少降低了細胞對水的轉(zhuǎn)運能力，黏液纖毛清除功能減弱，氣道黏液黏稠不易咳出[18-19]。黏液在氣道中聚積為病原微生物創(chuàng)造生長環(huán)境，從而加重炎癥反應(yīng)，使患者肺功能進一步惡化。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，COPD模型組肺組織中AQP5mRNA和蛋白表達顯著降低。與模型組相比，二陳湯中、高劑量組血漿中AQP5mRNA和蛋白的表達顯著增強。提示二陳湯提高肺組織中AQP5基因的表達而改善水的轉(zhuǎn)運，降低黏液的黏稠度，利于黏液的排出及吸收，減輕炎癥反應(yīng)。至于二陳湯上調(diào)AQP5基因表達的的機制仍需深入研究。