親和層析在蛋白質研究中的應用

董志萍

摘要：親和層析是根據將相互間具有高度特異親和性的兩種物質之一作為固定相，利用生物分子與特定的固定配基之間的親和力不同而使生物分子得以分離的層析方法。親和層析已廣泛應用于生物分子的分離和純化，如酶、抗原、激素、糖蛋白及輔助因子以及細胞、細胞器等。特別是對于那些分離流程長、雜質多、使用常規方法難以分離的生物分子來說，親和層析具有獨特的優越性。本文主要介紹在生物因子、免疫幾類常規親和層析的原理及其在蛋白質的分離純化以及分析鑒定方面的應用。

關鍵詞：親和層析；蛋白質；應用與發展

親和層析是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。利用偶聯親和配基的親和吸附介質為固定相親將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基，使用親和吸附劑填充色譜柱，當含有被分離物質的混合物隨著流動相流經色譜柱時，親和吸附劑便進行選擇吸附，它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要簡單操作即可使某待分離的生物大分子從復雜的混合物中分離出來，達到千倍以上的純化，并保持較高的活性，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質的有力工具。

1 親和配基的選擇與分類

親和層析介質由配基和載體構成，配體是能與目的產物大分子相結合、解離的生物結構和分子，為決定親和層析成功的關鍵因素。配體必須具有以下特征：與待分離的物質有適當的親和力、與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性、與基質穩定的共價結合、自身應具有較好的穩定性。根據配體的特性并結合其與生物大分子之間相互作用體系的不同，親和配基主要分為兩大類。

1.1 特異性配體

特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體，能夠分離特定單克隆抗體或多克隆抗體，如抗原和抗體、酶和它的抑制劑等。其中免疫親和層析是利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統。免疫親和層析應用十分廣泛，許多典型的親和層析純化蛋白質的過程已經使用了單克隆抗體作為親和配體。目前，利用抗體-抗原模式，有可能得到每一種目標蛋白的單抗，然后以單抗為配基，通過親和層析技術分離純化目標蛋白質。此種方法的純化倍數、活性回收率非常高。免疫檢測法利用被標記的抗體或模擬分析物來進行間接的分析。常用標記有熒光標記、酶標記、化學熒光等。脫氫酶和激酶等需要在輔酶存在的情況下才能表現出生物活性，即輔酶能與脫氫酶和激酶之間通過親和作用相互結合，因此這些輔酶可用作脫氫酶和激酶的親和配基。通常具有高的選擇性，典型的物質對有酶-底物、酶-抑制劑、激素-受體等。

1.2 通用性配體

一般通用性配體特異性不是很強，是能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體，如凝集素可以結合各種糖蛋白，凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖結合蛋白。它們具有不同的糖結合專一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結構的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。固定化金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質的分離系統。目的蛋白質表面暴露的供電子氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質與固定化金屬離子結合。過度金屬離子通過亞氨基二乙酸被固定在固定相載體表面，用作親和吸附蛋白質的配基。

2 親和層析的應用

2.1 親和層析法分離純化蛋白質

蛋白質組學中親和層析主要被用作選擇性地預處理和濃縮待處理樣品，應用A蛋白親和層析法，從采集的小鼠腹水中純化抗凝血因子Ⅶ單克隆抗體，能夠得到純度較高的單克隆抗體，適用于高純度單克隆抗體的制備。另外，親和層析也可濃縮蛋白，將所有蛋白分類成多個組群以便進一步分析鑒定。

在對樣品分析鑒定前，可借助親和層析進行預處理，減輕樣品的復雜程度。同時親和層析能被用在蛋白水解消化之前或之后的蛋白以及肽鏈的分離。親和層析分析糖蛋白是利用目標聚糖甚至在蛋白質水解以后都能被凝集素識別而進行的，利用抗體和某些IMAC的親和層析可用來分離并濃縮糖肽。

2.2 親和色譜純化生長因子

親和層析也被用來研究生長因子間的相互作用如如初分離純化舟山眼鏡蛇毒，獲得的蛇毒粗毒進行分子篩色譜，對含NGF部分進行離子交換色譜，分步洗脫。用0.02mol/L pH7.0 PBS平衡親和色譜柱，取2g舟山眼鏡蛇毒，用同樣緩沖液溶解，離心去除沉淀，緩慢加樣，然后用PBS洗去雜蛋白。親和色譜純化舟山眼鏡蛇毒的洗脫曲線中，分隔帶明顯，親和色譜分離NGF得率比傳統分離方法提高將近50%。

2.4 親和層析與其他分析技術相結合

生物分子的分離純化，有時需要多種分離手段同時使用，在進行重組蛋白的純化時，綜合使用多種技術，一般來說，在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：應選擇不同分離純化機理的方法聯合使用、應首先選擇能除去含量最多雜質的方法、應盡量選擇高效的分離方法、應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段。近年來的另一發展趨勢是尋求更加優化的系統設計和安排形式，從而獲得快速、優良的選擇性以及很大數量被檢測的樣品。親和層析與其他分析技術串聯結合即可很好地達到這一目的，色譜技術是目前所知的最好的分離方法之一，而親和層析在其中也發揮著不可替代的作用，相信其在未來的發展也必將大有可為。

參考文獻：

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