光甘草定凝膠和乳膏劑的體外釋藥研究

魏嘉寶 楊凡 謝加庭 吳燕紅 蔡延渠 李苑新

中圖分類號 R944.2+1；R944.9 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2346-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.10

摘 要 目的：比較光甘草定凝膠和乳膏劑的體外釋放度和透皮特性，為遴選研發(fā)其新劑型提供依據(jù)。方法：制備光甘草定凝膠和乳膏劑，采用垂直式Franz擴散池法，以微孔濾膜、豬皮為透皮屏障進行體外釋放度試驗和體外透皮試驗，分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h取樣測定，比較光甘草定凝膠和乳膏劑中光甘草定的體外釋放度（Fn）、透皮量（Qn）、透皮率（Sn）及光甘草定在豬皮中的滯留量。結果：光甘草定凝膠劑24 h時光甘草定的Fn、Qn、Sn分別為91.42%、902.81 μg、33.19%，其透皮動力學擬合方程為Sn= -1.8t3+3.2t2-0.4t+0.6，光甘草定在豬皮中的滯留量為（280.86±66.2） μg（n=3）；光甘草定乳膏劑24 h時光甘草定的Fn、Qn、Sn分別為83.63%、396.48 μg、15.86%，其透皮動力學擬合方程為Sn=-1.1t3+2.3t2-0.3t+0.15，光甘草定（直徑1.5 cm圓形）中豬皮的滯留量為（207.11±47.5） μg（n=3）。結論：光甘草定凝膠中光甘草定的Fn、Qn、Sn及其在豬皮中的滯留量均高于光甘草定乳膏劑。

關鍵詞 光甘草定；凝膠；乳膏劑；體外釋放試驗；透皮試驗

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare the in vitro release rate and transdermal characteristics of Glabridin gel and cream， and to provide evidence for the selection and R&D of new dosage form. METHODS： Glabridin gel and cream were prepared. The in vitro release and transdermal test were performed by using HPLC and vertical Franz diffusion cell method with microporous membrane and pig skin as transdermal barrier； in vitro release rate （Fn）， permeation volume （Qn）， transdermal rate （Sn） of glabridin and pig skin residue of Glabridin gel and cream were compared via sampling at 1， 2， 4， 6， 8，10， 12， and 24 h. RESULTS： Fn， Qn and Sn of Glabridin gel were 91.42%， 902.81 μg， 33.19% at 24 h； fitting equation of transdermal dynamics were Sn=-1.8t3+3.2t2-0.4t+0.6； the retention of glabridin in pig skin （1.5 cm diameter circle） was （280.86±66.2） μg （n=3）. Fn， Qn and Sn of Glabridin cream were 83.63%， 396.48 μg， 15.86%； fitting equation of transdermal dynamics were Sn=-1.1t3+2.3t2-0.3t+0.15； the retention of glabridin in pig skin was（207.11±47.5） μg （n=3）. CONCLUSIONS： Fn， Qn and Sn as well as retention of pig skin of glabridin in Glabridin gel are higher than those of Glabridin cream.

KEYWORDS Glabridin； Gel； Cream； In vitro release test； Transdermal test

光甘草定是從光果甘草中提取的一種脂溶性異黃酮類化合物，具有強抗炎、抗氧化及抗過敏等作用[1]，不僅能抑制前列腺素E2（PGE2）[2]、一氧化氮（NO）[3]、腫瘤壞死因子α（TNF-α）[4]等致炎因子的釋放，還能抑制髓過氧化物酶（MPO）的活性，從而減輕葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎炎癥反應[5]。光甘草定能抑制粒細胞性白血病細胞致炎因子白三烯（LTB4）、血栓素（B2）的產生[6]，對皮膚炎癥有著顯著抗炎療效。盡管目前市面上有水包油（O/W）的光甘草定乳膏，但乳膏存在制備工藝復雜、質量難以控制等缺點，故需開發(fā)其新劑型。本研究通過制備光甘草定凝膠和乳膏劑，采用垂直式Franz擴散池法進行體外釋放度和體外透皮試驗，分析兩種劑型的體外釋藥和透皮特性，為研發(fā)光甘草定的新劑型提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀和VWD紫外檢測器（美國安捷倫公司）；YB-P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器制造廠）；EPED-10TJ實驗室級超純水機（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；BP 211D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，分度值：0.01 mg）；DW-86W100臥式超低溫保存箱（青島海爾特種儀器有限公司）；FJ-200高速分散均質機（上海索映儀器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

光甘草定對照品（成都普思生物科技有限公司，批號：PSO138-0020，純度：99.07%）；光甘草定原料藥（西安天廣源生物科技有限公司，批號：160803，純度：90.23%）；卡波姆940（廣州勝欣化工科技有限公司）；吡咯烷酮羧酸鈉和吡咯烷酮羧酸鋅（廣州途優(yōu)化工有限公司）；維生素B6和維生素E（北京索萊寶科技有限公司）；甘草酸二鉀和肉桂酸鉀（珠海市雙博杰科技有限公司）；丁二醇、丙二醇、乙醇和三乙醇胺（天津市大茂化學試劑廠）；單硬脂酸甘油酯和十八醇（天津百世化工有限公司）；聚氧乙烯硬脂醇醚（廣州市拓為精細化工有限公司）；角鯊烷（西安百川生物科技有限公司）；尼泊金丙酯（天津市福晨化學試劑廠）；改良桃膠（廣東藥科大學中藥開發(fā)研究所自制）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

廣西巴馬小型豬，♀，3月齡，體質量約20 kg，由南方醫(yī)科大學實驗動物科技發(fā)展有限公司提供，生產許可證號：SCXK（粵）2016-0041，批號：20180316。

2 方法與結果

2.1 光甘草定凝膠與乳膏劑的制備

2.1.1 光甘草定凝膠 根據(jù)本課題組前期處方篩選研究中已確定的處方，稱取吡咯烷酮羧酸鈉6 g、吡咯烷酮羧酸鋅0.2 g、維生素B6 0.3 g、甘草酸二鉀0.2 g、肉桂酸鉀0.2 g，加入純凈水85 mL，攪拌使溶解完全；加入以丁二醇-丙二醇-乙醇（2 ∶ 2 ∶ 0.6，V/V/V）為混合溶劑的光甘草定溶液（該溶液中光甘草定含量為1.3 g/mL），在300 r/min攪拌條件下緩慢加入卡波姆940 2 g和改良桃膠1.8 g，溶脹后加入三乙醇胺1.0 g，采用高速剪切機于 10 000 r/min條件下均質3 min，取出，分裝，密封保存。

2.1.2 光甘草定乳膏劑 根據(jù)本課題組前期處方篩選研究中已確定的處方，稱取吡咯烷酮羧酸鈉3 g、吡咯烷酮羧酸鋅0.2 g、維生素B6 0.1 g、甘草酸二鉀0.3 g、肉桂酸鉀0.1 g，加入純凈水85 g，85 ℃水浴加熱，加入以丁二醇-丙二醇-乙醇（2 ∶ 2 ∶ 0.5，V/V/V）為混合溶劑的光甘草定溶液（該溶液中光甘草定含量為1.1 g/mL），攪拌使溶解完全，作為水相溶液；另取聚氧乙烯硬脂醇醚 1.4 g、單硬脂酸甘油酯1.6 g、十八醇1.2 g、角鯊烷3.0 g、維生素E 1.0 g及尼泊金丙酯0.1 g，85 ℃水浴加熱，攪拌使熔化完全，加入同溫度水相溶液，采用高速剪切機于10 000 r/min條件下均質3 min，取出，放至室溫，分裝，密封保存。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1%冰醋酸（53 ∶ 47，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：282 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL[7]。在該色譜條件下，理論板數(shù)按光甘草定的峰面積計不低于5 000。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取光甘草定對照品，用30%甲醇溶解制成質量濃度為10 mg/mL的對照品溶液。準確移取光甘草定對照品溶液，用30%甲醇制成質量濃度分別為1.0、5.0、10.0、40.0、80.0、100 μg/mL的系列對照品溶液，取20 μL進樣測定。以光甘草定的質量濃度為橫坐標（x）、光甘草定的峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=20.04x+8.466 6（R2= 0.999 9）。結果表明，光甘草定檢測質量濃度的線性范圍為1.0～100 μg/mL，該方法的檢測限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。

2.2.3 供試品溶液與陰性樣品溶液的制備 精密稱取0.1 g光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑，分別置于10 mL量瓶中，加入30%甲醇至刻度，搖勻，吸取1 mL用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。同法制備不含光甘草定的空白凝膠和空白乳膏劑的陰性樣品溶液。

2.2.4 專屬性試驗 分別取“2.2.2”項下光甘草定對照品溶液和“2.2.3”項下供試品溶液、陰性樣品溶液各20 μL，進樣測定，記錄色譜。結果顯示，供試品溶液中的光甘草定峰與相鄰色譜峰能達到基線分離，分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測定光甘草定的峰面積，計算RSD。結果顯示，峰面積的RSD為0.15%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 按“2.1”項下方法分別平行制備光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑各6份，分別按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，計算光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑中光甘草定的含量。結果顯示，光甘草定凝膠中光甘草定的平均含量為5.4 mg/g，RSD為0.67%（n=6）；光甘草定乳膏劑中光甘草定的平均含量為4.8 mg/g，RSD為0.48%（n=6），表明樣品的重現(xiàn)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 將光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑的供試品溶液分別放置0、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h后吸取20 μL進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，光甘草定凝膠中光甘草定峰面積的RSD為0.41%（n=10），光甘草定乳膏劑中光甘草定峰面積的RSD為0.23%（n=10），表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 回收率試驗 分別吸取光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑的供試品溶液5.0 mL，各6份，準確加入光甘草定對照品溶液各25 μL，搖勻，取20 μL進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果顯示，光甘草定凝膠中光甘草定的平均加樣回收率為100.73%，RSD為1.35%（n=6）；光甘草定乳膏劑中光甘草定的平均加樣回收率為98.66%，RSD為1.16%（n=6），表明兩種制劑中光甘草定的加樣回收率均符合相關要求。

2.3 體外釋放試驗

按體外釋放試驗方法[8-9]，將0.8 μm的微孔濾膜固定在Franz擴散池上，在接收池中加滿30%的甲醇生理鹽水溶液作為接收液，（37±0.1） ℃水浴加熱，以（300±5） r/min定速磁力攪拌0.5 h，分別向供給室加入1.0 g光甘草定凝膠（光甘草定為5.4 mg）和光甘草定乳膏（光甘草定為4.8 mg），用密封膠封口，以防溶劑蒸發(fā)。分別于1、2、4、6、8、12、24 h移取接收液1.0 mL，隨即補回1.0 mL等溫空白接收液，接收液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL濾液進樣測定，計算光甘草定的含量，再按公式計算累積釋放度（Fn）。Fn=（cnV+[∑][i=1][n-i]ciV0）/W×100%，式中，cn為第n個時間點樣品的質量濃度，V為接收池體積，ci為第i個時間點樣品的質量濃度，V0為每次取樣的體積，W為所取凝膠和乳膏劑中光甘草定的質量（凝膠W=5.4 mg；乳膏劑W=4.8 mg）。光甘草定凝膠和乳膏劑中光甘草定的體外累積釋放度結果見表1，體外釋放曲線見圖2。

通過SPSS 17.0軟件對表1中1～24 h不同時間點的體外釋放度進行配對t檢驗分析，結果顯示，光甘草定凝膠的體外累積釋放度明顯高于光甘草定乳膏劑，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。

2.4 體外透皮試驗

2.4.1 離體豬皮的制備與處理 選取皮膚無紅腫、充血、破損等現(xiàn)象的健康合格3月齡巴馬小型豬，頸動脈放血致死，剃毛，剝取腹部的豬皮，小心去除皮下脂肪及組織，用大量的生理鹽水反復沖洗干凈，置于保鮮膜封口袋中，加入少許的生理鹽水，置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存，備用。

2.4.2 試驗步驟 取出經“2.4.1”項下方法處理好的離體腹部豬皮，在常溫下解凍，切成所需小塊，用生理鹽水洗凈并用濾紙吸干豬皮上下表面的水分，固定在Franz擴散池，使表皮角質層朝上，豬皮下表面接觸擴散池液面（直徑1.5 cm的圓形），按體外透皮試驗方法進行試驗[10]。在接收池中加入30%甲醇的生理鹽水，（37±0.1） ℃水浴加熱，以（300±5） r/min定速磁力攪拌1 h，向供給室中分別加入0.5 g光甘草定凝膠（光甘草定為2.72 mg）和光甘草定乳膏劑（光甘草定為2.4 mg），用密封膠封口，以防溶劑蒸發(fā)。分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h移取接收液1.0 mL，隨即補回1.0 mL等溫空白接收液，接收液用0.22 μm微孔濾膜過濾，吸取20 μL濾液進樣測定，計算光甘草定的含量。再按公式計算光甘草定的累積透皮量（Qn）和累積透皮率（Sn），并行配對t檢驗。Qn=cnV+[∑][i=1][n-i]ciVi，Sn=Qn/W×100%，式中，cn為第n個時間點樣品的質量濃度，V為接收池體積，ci為第i個時間點樣品的質量濃度，Vi為每次取樣的體積，W為所取凝膠和乳膏劑中光甘草定的質量（凝膠W=2.72 mg；乳膏劑W=2.4 mg）。光甘草定凝膠和乳膏劑的體外透皮試驗結果見表2，Sn-時間曲線見圖3。

由表2可以看出，光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑的Qn、Sn差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中，在1、2、4、6、8、10、12、24 h時，光甘草定凝膠的Sn分別是光甘草定乳膏劑的6、7、3.2、2.7、2.6、2.5、2.5、2.1倍。由此表明，2 h前光甘草定凝膠的Sn比光甘草定乳膏劑更高，2 h后差距逐漸減小；24 h時光甘草定凝膠的Qn明顯高于光甘草定乳膏劑。

2.4.3 動力學模型擬合方程 運用SPSS 17.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)結果進行一元線性回歸模型、Power冪函數(shù)模型、Logistic模型、Quadratic二次模型、Compound復合模型和Cubic三次模型的擬合，擬合結果見表3（表中R2代表相關系數(shù)，F(xiàn)代表方差檢驗值，P代表顯著性水平）。

由表3結果可知，光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑的最優(yōu)透皮動力學模型為Cubic三次模型，凝膠和乳膏劑的透皮動力學方程分別為Sn=-1.8t3+3.2t2-0.4t+0.6、Sn=-1.1t3+2.3t2-0.3t+0.15。通過對上述兩動力學方程作一階求導并相減得到的結果可知，光甘草定凝膠的Sn高于乳膏劑。

2.4.4 豬皮中藥物滯留量測定 體外透皮試驗結束后隨即取下試驗豬皮，分別將豬皮表面的光甘草定凝膠及其乳膏劑沖洗干凈，剪下有效透皮部分（直徑1.5 cm的圓形），然后將豬皮剪碎，放入小燒杯中，加入定量30%的甲醇溶液，超聲30 min，取適量溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾，吸取20 μL進樣測定，計算豬皮中藥物滯留量和滯留率。結果顯示，豬皮（直徑1.5 cm的圓形）中光甘草定凝膠的滯留量為（280.86±66.2） μg，滯留率為（4.00±0.9）%（n=3）；光甘草定乳膏劑的滯留量為（207.11±47.5） μg，滯留率為（3.13±0.7）%（n=3）。

3 討論

光甘草定為中等極性的異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化及抗過敏等多種功效[1]，可用于研發(fā)抗炎、抗過敏凝膠、乳膏類醫(yī)護產品。本實驗意在通過光甘草定凝膠和乳膏劑的體外釋放及透皮試驗為后續(xù)的產品研發(fā)尤其在產品加藥量及患者用藥選擇等方面提供參考依據(jù)。實驗中凝膠劑的Sn比乳膏劑高，可能是因為乳膏劑中含有油相成分，黏度大，而凝膠中只有水相，黏度較乳膏劑小，藥物更容易釋放；2 h后的凝膠Sn與乳膏劑的差距逐漸減小，可能是因為豬皮中含藥量過高以至于產生極化濃度現(xiàn)象使得Sn有所下降，而乳膏劑中由于其釋藥速度趨于平緩，在乳膏、豬皮與接收池三者間能形成一個良好的動態(tài)滲透平衡，藥物的Sn能緩慢增大至最大值，并保持最大值。另外，凝膠之所以能在透皮開始之初Sn就高，可能因為凝膠劑中主要為水相成分，能起到一定的水合作用，促進了透皮吸收。

本研究結果表明，光甘草定凝膠和光甘草定乳膏劑的體外釋藥及透皮特性存在顯著差異，二者的透皮動力學模型符合Cubic三次模型，光甘草定凝膠的Fn、Qn、Sn都明顯高于乳膏劑。筆者認為，對于過敏急性癥狀宜選用光甘草定凝膠，而光甘草定乳膏劑釋藥較為緩慢持久，則更適用于慢性炎癥患者。

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（收稿日期：2018-05-07 修回日期：2018-07-17）

（編輯：鄒麗娟）