銀翹散中抗流感病毒成分與神經氨酸酶的分子對接研究

郭小華 朱燕亮 程齊來

中圖分類號 R287；R914.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2351-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.11

摘 要 目的：研究銀翹散中17個主要抗流感病毒成分與神經氨酸酶（NA）的結合模式和相互作用。方法：采用CORINA、UCSF Chimera 1.3、AutoDock Tools 1.5.4等分子對接軟件，將銀翹散中的甘草素、甘草苷、綠原酸、3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸等17個活性成分及陽性對照扎那米韋的二維結構轉化成三維結構，確立其空間坐標，再設置受體蛋白NA的網格，并運行對接程序進行對接運算。以估計抑制常數（Ki）和結合自由能（ΔGbind）為參考指標，比較對接分子的虛擬活性差異，并從對接構象上分析產生活性差異的原因。結果：在17個活性成分中，綠原酸對接的Ki值為1.20 ?mol/L，ΔGbind值為-8.08 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ），優于扎那米韋（Ki值為2.26 ?mol/L，ΔGbind值為-7.70 kcal/mol）；3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸對接數據最差，Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L、 -5.22 kcal/mol。在對接構象上，綠原酸與扎那米韋相似，在空間上更加匹配NA活性腔的活性位點，占據了除S5以外的所有活性位點，呈現出與NA較強的結合作用。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸的平面分子結構限制了其與NA多個活性位點結合，對接構象不牢固。結論：綠原酸可能是銀翹散中最強的抗流感病毒活性成分，其虛擬活性強于扎那米韋；3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸空間上與NA活性腔不匹配，虛擬活性最弱。本研究可為NA抑制劑的開發提供一定的理論指導。

關鍵詞 銀翹散；活性成分；抗病毒；神經氨酸酶；分子對接

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the binding mode and interaction of 17 main antiviral components in Yinqiao powder with neuraminidase （NA）. METHODS： The two-dimensional structure of 17 active components as glycyrrhizin， liquiritin， chlorogenic acid， 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid in Yinqiao powder and positive control zanamivir were transformed into three-dimensional structure by using CORINA，UCSF Chimera 1.3 and AutoDock Tools 1.5.4 molecular docking software. Then the grids of acceptor protein NA were set up， and the docking program was run to perform the docking operation. Using estimation inhibit constant （Ki） and binding energy （ΔGbind） as reference indexes， the difference of virtual activity of the docking moleculars were compared， and its reasons were analyzed from the docking conformation. RESULTS： In the 17 active components， Ki value for molecule docking of chlorogenic acid was 1.20 ?mol/L， and ΔGbind was -8.08 kcal/mol （1 kcal=4.184 kJ）， which was better than zanamivir （Ki 2.26 ?mol/L， ΔGbind -7.70 kcal/mol）. Ki and ΔGbind of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid were 149.41 ?mol/L and -5.22 kcal/mol， which were the worst among 17 compounds. Chlorogenic acid and zanamivir were more closely matched to the active sites of NA active cavity in space from the docking conformation， and occupied all the active chambers except S5， which presented a strong binding effect with NA. The docking conformation of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid was not strong as its plane structure restricted the combination with NA active sites. CONCLUSIONS： Chlorogenic acid is the strongest antiviral activity component in the Yinqiao powder， whose virtual activity is even stronger than zanamivir. The virtual activity of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid may be the weakest as its mismatching with the NA active cavity. This study may provide some theoretical guidance for the development of NA inhibitors.

KEYWORDS Yinqiao powder； Active component； Antivirus； Neuraminidase； Molecular docking

流感是由流感病毒引起一種常見的疾病，而流感病毒易發生變異的生物學特性和傳播速度快的特點，決定了抗流感病毒藥物研發的必要性。研究發現，流感病毒增殖后要從位于宿主細胞的唾液酸殘基中釋放出來并且感染其他宿主細胞，這一過程中需要神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）的參與[1]。

NA又稱唾液酸酶，是一種流感病毒表面糖蛋白，在流感病毒復制和感染過程中起關鍵作用[2]。NA的晶體結構是一個四聚體結構，由4個相同的亞基以二硫鍵形式連接而成[3]。這4個部分分別被稱為尾、跨膜域、莖和球狀頭。 Stoll V等[4]研究發現，NA的活性位點具有高極性，其活性區域有5個活性位點。在A型和B型流感病毒每個糖蛋白亞單位表面的口袋中都存在NA的活性位點，并且這些活性位點周圍存在的氨基酸序列均是高度保守的，這有利于NA抑制劑的設計和開發[5]。

銀翹散是由金銀花、連翹、牛蒡子等9味中藥組成的復方制劑，在臨床上被廣泛應用于抗流感治療[6]。其中的金銀花、連翹、牛蒡子和生甘草是主要的抗病毒組分。金銀花中的黃酮類、有機酸類、三萜皂苷類成分有明顯的抗病毒作用[7]，尤其是有機酸類的綠原酸對呼吸道病毒的抑制作用明顯[8]；連翹中的連翹苷、連翹酯苷，甘草中的甘草素、甘草苷，牛蒡子中的牛蒡子苷等成分均有抗病毒活性[9]。

研究表明，銀翹散中的活性成分，如甘草中的甘草素、甘草苷、異甘草素、異甘草苷、芒柄花素，連翹中的連翹苷、連翹酯苷，金銀花中的綠原酸、金絲桃苷，薄荷中的醉魚草苷、金合歡素，牛蒡子中的牛蒡子苷、染料木素，淡豆豉中的大豆素、6-甲氧基大豆素及荊芥中的橙皮苷和3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸等[9-14]，均有較好的抗流感病毒作用，作用機制可能與其抑制NA活性有關[15]。因此，本文采用分子對接的方法模擬了銀翹散中甘草素、甘草苷等17個主要的抗病毒成分與NA的結合模式，并探討其與NA的作用差異，推測可能的構效關系，為NA抑制劑的開發提供一定理論指導和實驗依據。

1 材料

M4500-N000臺式電子計算機[聯想（北京）有限公司]；ChemBioDraw Ultra 11.0軟件（CambridgeSoft公司，用于繪制各成分的化學結構式）；UCSF Chimera 1.3軟件（美國加州大學）；AutoDock Tools 1.5.4、AutoGrid 4.2、AutoDock 4.2軟件（美國斯克利普斯研究所）；Discovery Studio 2.5 Visualizer、Python 2.5軟件（美國Accelrys公司，用于分子對接）；CORINA工具（http：//www.molecular-networks.com）（美國Molecular Networks GmbH公司，用于配體分子三維結構的轉化）；Brookheaven蛋白數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb.com，用于下載靶蛋白的晶體結構）。

2 方法

2.1 分子對接計算前處理

2.1.1 配體分子的選取及對接前處理 銀翹散中成分復雜，其中黃酮類等被認為是具有抗流感病毒的活性成分[7]。筆者選取了銀翹散中甘草素、甘草苷等17個抗流感病毒成分作為分子對接的配體分子，且以NA蛋白原始配體分子（扎那米韋）為陽性對照。各配體分子名稱及結構詳見表1。

將表1中18個配體分子的平面結構用CORINA工具在線轉化成三維結構，并在UCSF Chimera程序中將其置于對接靶蛋白的活性位點處，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的配體分子置于AutoDockTools（ADT）軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

2.1.2 受體分子的選取及對接前處理 從Brookheaven蛋白數據庫中獲取受體NA的晶體結構，pdb代碼為1A4G[16]。在UCSF Chimera程序中將NA蛋白晶體結構中的水分子、原始配體等剔除，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的受體分子置于ADT軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

2.2 分子對接運算

在ADT軟件中，設置pdbqt格式文件的配體分子和受體分子的網格，并運行AutoGrid生成必要的圖像文件，最后運行AutoDock進行分子對接運算。以估計抑制常數（Inhibit constant，Ki）和結合自由能（Binding energy，ΔGbind）為參考指標，獲取18個配體分子與NA蛋白對接的ΔGbind和Ki值，并將銀翹散中17個活性成分的ΔGbind和Ki值與扎那米韋的ΔGbind和Ki值進行比較。最后從最優構象上分析配體分子與NA的結合模式，從分子水平探討兩者的結合作用。

3 結果

3.1 分子對接運算結果

扎那米韋、甘草素等18個配體分子與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值見表2。

如表2所示，扎那米韋（配體分子1）的Ki值和ΔGbind值分別為2.26 ?mol/L和-7.70 kcal/mol，對接的配體分子中數據與之接近的為配體分子2（金合歡素）、3（橙皮苷）和6（金絲桃苷），有機酸類的配體分子15（綠原酸），多酚類的配體分子16（牛蒡子苷）、17（連翹苷）。對接數據與扎那米韋相差最大的是配體分子14（3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸），Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L和 -5.22 kcal/mol。

3.2 分子對接數據分析

扎那米韋與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值均較小，說明扎那米韋在與NA受體進行分子對接時，空間上相互匹配，結合比較牢固，構象比較穩定，對NA蛋白表現出很強的虛擬抑制活性。

銀翹散中17個成分與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值較小的主要有金合歡素、橙皮苷、金絲桃苷、綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷等。與扎那米韋對接數據接近的是綠原酸、牛蒡子苷，其中綠原酸對接的Ki值和ΔGbind值甚至低于扎那米韋，分別為1.20 ?mol/L和-8.08 kcal/mol，表現出與NA蛋白很強的結合能力，結合構象也比較穩定，可能對NA存在很強的虛擬抑制活性。對接數據最不理想的是3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸，Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L和-5.22 kcal/mol，表現出與NA蛋白較弱的結合能力，結合構象不穩定，對NA的虛擬抑制活性較差。

3.3 分子對接構象分析

Stoll V等[4]的研究表明，NA活性腔由5個活性位點（S1～S5）構成。NA活性位點S1主要是靜電區域，易與配體分子形成鹽橋；S2為帶負電區域，主要與配體分子的極性基團形成氫鍵相互作用力，是配體分子產生活性的關鍵區域之一；S3中的TRP178是一個關鍵氨基酸，與配體分子中的疏水基團形成疏水作用；S4屬于一個大的疏水口袋，很難被配體分子占據；S5中的極性氨基酸GLU274和GLU276也主要與配體分子形成氫鍵相互作用力[4]。利用UCSF Chimera程序分析NA晶體結構，其活性位點分布圖詳見圖1（以棒狀圖和溶劑化圖兩種不同形式體現）。

為了更直觀地反映各成分與NA蛋白的結合作用，筆者從分子對接構象上進行分析。將綠原酸和3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA的對接構象同扎那米韋與NA對接構象進行比較，分析該3種配體分子與NA各活性位點的結合作用。

3.3.1 扎那米韋與NA對接構象分析 扎那米韋與NA對接的構象詳見圖2。

由圖2B可見，扎那米韋的整個分子結構基本能占據NA的活性腔；由圖2A可見，其與活性位點S1、S3、S5結合緊密。扎那米韋結構中的羧基部分伸入到S1活性位點，羧基上的羥基和羰基分別與周圍的氨基酸TYR408、ARG153、ARG115形成了4個氫鍵；胍基結構靠近S2活性位點，與氨基酸ASP148形成了氫鍵，但在空間上并未完全占據該活性位點；乙酰氨基結構與S3活性位點形成疏水作用的同時，還與該位點的關鍵氨基酸TRP176形成了氫鍵；醇羥基結構則深入S5活性位點，并與該位點的極性氨基酸GLU274形成了氫鍵。S4活性位點類似于一個大的疏水口袋，很難被配體分子占據，故扎那米韋沒能與之形成相互作用。

3.3.2 綠原酸與NA對接構象分析 綠原酸與NA對接的構象詳見圖3。

由圖3B可見，綠原酸與NA的對接構象與扎那米韋相似，占據了NA活性腔的主要活性位點，其中綠原酸結構中的酯鏈部分落在NA活性腔的S1活性位點，酯鏈的羰基氧分別與周圍的氨基酸TYR408、ARG153、ARG115形成了4個氫鍵，酚羥基結構落入S3活性位點，并與關鍵氨基酸TRP176形成了氫鍵。

與扎那米韋不同的是，綠原酸結構中的環己醇部分與S2活性位點的結合，除了醇羥基與氨基酸ASP148形成氫鍵外，整個環己醇結構也嵌入S2活性位點，空間上與之相匹配，結合較牢固。由此推測，該作用方式可能是綠原酸對接數據優于扎那米韋的原因之一。另外，綠原酸結構并未伸入到由極性氨基酸構成的S5活性位點，提示在對其進行結構修飾時，可以考慮在酚羥基結構上引入部分極性基團，使之延伸靠近S5活性位點，并與周圍氨基酸形成相互作用，有助于增強綠原酸與NA的結合作用，提高其活性。

3.3.3 3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA對接構象分析 3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA對接的構象詳見圖4。

由圖4可見，3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸雖然能夠靠近S1和S3活性位點，可與S1活性位點的多個氨基酸形成了氫鍵，但整個平面分子在空間上卻很難與其他活性位點結合，尤其是S2和S5活性位點，導致其與NA結合不牢固，虛擬抑制活性較差。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸抗病毒活性的對接數據最不理想，主要原因可能是其平面結構限制了其與NA活性腔的結合。

銀翹散中其他抗病毒活性成分與NA對接的空間構象基本相似，因結構存在差異，在與NA結合時，結合位點和相互作用力會有差別，使得虛擬活性也不盡相同。

4 討論

本研究以上市的NA抑制劑扎那米韋為陽性對照，利用分子對接的方法模擬了銀翹散中主要的17個抗流感病毒活性成分與NA的相互作用。通過分析各成分與NA的對接數據（Ki值、ΔGbind值）發現，綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷、金合歡素、橙皮苷、金絲桃苷與扎那米韋的對接數據接近，其中綠原酸的對接數據最接近扎那米韋。故筆者推測這6種成分對NA的虛擬抑制活性較強，是銀翹散中主要的抗病毒成分。

從對接構象上看，NA活性腔中的S1、S2、S3、S5活性位點是NA抑制劑發揮作用的主要位點。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸是一個平面分子，限制了其與NA多個活性位點的結合，導致對接數據不理想、對接構象不穩定、對NA的虛擬抑制活性較弱。綠原酸與扎那米韋的對接構象相似，在空間上能與NA活性腔的多個活性位點結合，并與周圍的關鍵氨基酸形成氫鍵等，對接構象牢固，表現出對NA較強的虛擬抑制活性。與扎那米韋比較，綠原酸更加嵌入NA活性腔的S2活性位點，表現出更強的結合能力。但其離由極性氨基酸構成的S5活性位點較遠，與周圍氨基酸形成的相互作用力有限。在后續的研究過程中，可以考慮在酚羥基結構上引入部分極性基團，使之延伸靠近S5活性位點，以增強綠原酸與NA的結合能力，提高其活性。

參考文獻

[ 1 ] WANG Z，CHENG LP，ZHENG XH，et al. Design，synthesis and biological evaluation of novel oseltamivir derivatives as potent neuraminidase inhibitors[J]. Bioorg Med Chem Lett，2017，27（24）：5429-5435.

[ 2 ] ZHENG L，AI HX，LI SM，et al. Virtual screening approach to identifying influenza virus neuraminidase inhibitors using molecular docking combined with machine- learning-based scoring function[J]. Oncotarget，2017，8（47）：83142-83154.

[ 3 ] ENKHTAIVAN G，MUTHURAMAN P，KIM DH，et al. Discovery of berberine based derivatives as anti-influenza agent through blocking of neuraminidase[J]. Bioorg Med Chem，2017，25（20）：5185-5193.

[ 4 ] STOLL V，STEWART KD，MARING CJ，et al. Influenza neuraminidase inhibitors：structure-based design of a novel inhibitor series[J]. Biochem，2003，42（3）：718-727.

[ 5 ] 周正任，潘興瑜.病原生物學[M].北京：科學出版社，2001：180-185.

[ 6 ] KOTBAYASHI M，DAVIS SM，UTSUNMIYA T，et al. Antiviral effect of gingyo-san，a traditional Chinese herbal medicine，on influenza A2 virus infection in mice[J]. Am J Chin Med，1999，27（1）：53-62.

[ 7 ] 王亞丹，楊建波，戴忠，等.中藥金銀花的研究進展[J].藥物分析雜志，2014，34（11）：1928-1935.

[ 8 ] 劉恩荔，李青山.大孔吸附樹脂分離純化金銀花中總有機酸的研究[J].中草藥，2006，37（12）：1792-1796.

[ 9 ] 石鉞，石任兵.銀翹散抗流感病毒有效部位群化學成分的分離與鑒定[J].中國中藥雜志，2003，28 （1）：43-47.

[10] 石鉞，石任兵，劉斌，等.銀翹散抗流感病毒有效部位群中黃酮類成分研究[J].中國中藥雜志，2001，26（5）：320- 322.

[11] 石鉞，石任兵.銀翹散抗流感病毒有效部位各組分變化及歸屬分析[J].藥學學報，2007，42（2）：192-196.

[12] 玉素甫江·艾力.歐薄荷化學成分研究[D].北京：中國科學院大學，2012.

[13] 孫立卿.藏藥藍花荊芥抗HSV-I功效成分研究[D].西寧：青海民族大學，2016.

[14] 石鉞.銀翹散抗流感病毒作用的物質基礎研究及其作用機理初探[D].北京：北京中醫藥大學，2001.

[15] 彭勇，梁少偉，李文魁，等.國外抗流感病毒研究近況[J].國外醫學植物藥分冊，1999，14（1）：7-9.

[16] NEIL RT，ANNE C，ONKAR S，et al. Dihydropyrancarboxamides related to zanamivir：a new series of inhibitors of influenza virus sialidases. 2. crystallographic and molecular modeling study of complexes of 4-amino-4H-pyran-6-carboxamides and sialidase from influenza virus types A and B[J]. J Med Chem，1998，41（6）：798-807.

（收稿日期：2018-01-11 修回日期：2018-04-08）

（編輯：劉 萍）