HPLC—DAD同時測定藏藥潔白丸中4種成分的含量

張煒 宋文靜 馬青青 范瑩瑩 楊鳳梅 駱桂法

中圖分類號 R917；R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2381-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.18

摘 要 目的：建立同時測定藏藥潔白丸中沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為CAPCELL PAK MGⅡ C18，流動相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為220 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）和280 nm（沒食子酸、丁香酚），柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為46.50～2 325.00、21.28～1 064.00、4.38～219.20、4.17～208.40 μg/mL（r均≥0.999 1），檢測限分別為0.26、0.09、0.28、0.35 μg/mL，定量限分別為0.74、0.25、0.95、1.06 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（48 h）、重復性試驗的RSD均≤2.0%（n=6或n=7），加樣回收率分別為98.5%、97.6%、97.1%、101.6%，RSD分別為1.4%、1.9%、1.6%、1.7%（n=6）；6批潔白丸樣品中沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量范圍分別為4.28～7.02、1.09～4.90、0.25～0.60、0.30～0.72 mg/g。結論：建立的方法可用于藏藥潔白丸中沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量的同時測定。

關鍵詞 潔白丸；藏藥；含量；沒食子酸；丁香酚；土木香內(nèi)酯；異土木香內(nèi)酯；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in Tibetan medicine Jiebai pills simultaneously. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on CAPCELL PAK MGⅡ C18 column with of mobile phase composed of methanol-acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelengths were 220 nm for alantolatone and isoalantolactone， 280 nm for gallic acid and eugenol. The column temperature was at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone were 46.50-2 325.00， 21.28-1 064.00， 4.38-219.20 and 4.17-208.40 μg/mL， respectively （all r≥0.999 1）. The limits of detection were 0.26， 0.09， 0.28，0.35 μg/mL， and the limits of quantitation were 0.74， 0.25， 0.95， 1.06 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6 or n=7）. The recoveries were 98.5%， 97.6%， 97.1% and 101.6%， and RSDs were 1.4%， 1.9%， 1.6%， 1.7% （n=6）， respectively. The content of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in 6 batches of Baijie pills were 4.28-7.02， 1.09-4.90， 0.25-0.60， 0.30-0.72 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method can be used for content determination of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in Tibetan medicine Jiebai pills simultaneously.

KEYWORDS Jiebai pills； Tibetan medicine； Content； Gallic acid； Eugenol； Alantolatone； Isoalantolactone； HPLC

潔白丸成方于公元14世紀，出自藏族歷史上著名的大成就者唐東杰布（1385-1464），公元17世紀達莫門讓巴·洛桑曲扎將本方收載于其編著的《達莫·秘籍》中，公元19世紀貢珠·云丹嘉措編著《寶藏》稱本品為唐東杰布發(fā)明的“白丸”[1]。潔白丸應用于藏醫(yī)臨床有近千年的歷史，是治療消化道疾病的經(jīng)典驗方，其以確切的療效被流傳至今。20世紀初，經(jīng)過一系列的工藝改進和完善，演變?yōu)楝F(xiàn)用的“潔白丸”及其他劑型[2]。

潔白丸是健脾和胃、止痛止吐的常用胃藥，主要適用于胃寒疼痛、胸腹脹滿。方中以訶子為主藥，強身壯體，健脾止瀉，調(diào)節(jié)“三因”；輔以溫中和胃、開胃消食、驅(qū)風散寒的石榴、木瓜、肉豆蔻、草豆蔻、丁香、草果仁，以治療胃火衰退、胃痛；為了加強止痛止瀉、消除腹脹的作用，又配用了可清熱消炎、止痛止瀉、調(diào)理氣血的寒水石、沉香、紅花、石灰華、五靈脂膏、土木香、翼首草[3-4]。此方既可治療嘔吐泄瀉，又可用于胸腹脹滿，是藏族先民留下來的難得的治療消化道疾病的良方[5-7]。

經(jīng)查詢國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品數(shù)據(jù)庫，全國生產(chǎn)潔白丸及其他劑型的藏藥生產(chǎn)廠家有10余家，除丸劑外，還包括膠囊劑、片劑等。現(xiàn)有文獻報道多集中于潔白丸的物質(zhì)基礎及臨床功效研究上[4-7]，尚未見對潔白丸多組分含量測定的報道。本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法對潔白丸中沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的含量進行同時測定，以期為更科學、更全面地控制潔白丸的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 HPLC儀，包括2998光電二極管陣列檢測器（DAD）、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；AUW220D電子天平（日本Shimadzu公司）；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；Q250DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）； DK-S16恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

潔白丸（金訶藏藥股份有限公司，批號：20150402、20160102、20160201、20160202、20160519、20161105，規(guī)格：每丸質(zhì)量0.8 g）；丁香酚對照品（批號：110725- 201414，純度：≥98%）、土木香內(nèi)酯對照品（批號：110760-201510，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸對照品（批號：15061207，純度：≥98%）、異土木香內(nèi)酯對照品（批號：13041108，純度：≥98%）均購自北京恒元啟天化工技術研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測波長：220 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）、280 nm（沒食子酸、丁香酚）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。流動相梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯對照品適量，置于棕色量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制成沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為2.325、1.064、0.219、0.208 mg/mL的混合溶液，作為混合對照品貯備溶液。精密吸取上述溶液加甲醇稀釋10倍，制成質(zhì)量濃度分別為232.5、106.4、21.9、20.8 μg/mL的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取潔白丸樣品，研成細粉；精密稱取1.0 g，置于100 mL錐形瓶中；精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，85 ℃加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按潔白丸的處方配比，除去訶子、丁香、土木香制成陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備成潔白丸陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯在各自檢測波長下均與其他成分完全分離，各成分色譜峰之間及與相鄰色譜峰之間分離度均>1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾。理論板數(shù)以沒食子酸峰計不低于3 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備溶液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標準溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得到4種成分的線性范圍及回歸方程，結果表明，4種成分在各進樣范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，結果詳見表2。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限，結果詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，每次10 μL，記錄峰面積。結果，沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、0.7%、1.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取潔白丸樣品（批號：20160519），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、2.0%、1.5%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取潔白丸樣品（批號：20160519）粉末1.0 g，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯平均質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.7%、1.2%、1.8%、1.9%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取潔白丸樣品（批號：20160519）0.5 g，平行6份，分別加入約與樣品中沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯4種成分含量相同的4種對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.5%、97.6%、97.1%、101.6%，RSD分別為1.4%、1.9%、1.6%、1.7%（n=6），結果詳見表3。

2.10 樣品含量測定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果詳見表4。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

以沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯4種成分的提取率為指標，分別對超聲波提取和加熱回流提取方法、甲醇和乙腈兩種提取溶劑、50%～100%的提取溶劑（甲醇和乙腈）質(zhì)量分數(shù)、30～60 min的提取時間及提取溶劑的量（25和50 mL）進行綜合交叉考察。結果顯示，以25 mL的純甲醇加熱回流提取60 min所得供試品中4種待測成分的提取率最高。

3.2 流動相和流速的選擇

由于待測成分極性差異較大，且部分成分呈酸性，故首選酸性流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫。本試驗考察了甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液和甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，結果顯示，甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液分離效果最佳，僅使用乙腈-0.2%磷酸溶液的情況下，沒食子酸出峰時間較早，分離度不佳；而僅使用甲醇-0.2%磷酸溶液的情況下，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯無法完全分離。在試驗過程中筆者還發(fā)現(xiàn)，當采用0.8 mL/min的流速時，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯這2種成分的分離效果比1.0 mL/min的流速時進一步提高。因此，最終以甲醇-乙腈-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min[8]。

3.3 檢測波長的選擇

筆者查閱了相關文獻，沒食子酸的吸收波長λmax為270 nm[9]，丁香酚λmax為280 nm[10]，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯λmax為220 nm[11-12]。本試驗使用的HPLC儀配備了全波長DAD，在220 nm波長下已能檢測出4種待測成分的色譜峰，但沒食子酸在220 nm檢測波長下相比280 nm響應值低4～5倍，同時存在部分低波長雜質(zhì)峰干擾；綜合考慮4種成分色譜峰對稱因子、分離度、響應值、基線噪音，以及檢測方法對各含量范圍樣品的適用性、靈敏度等因素后，為了測定結果更加準確，最終確定建立220、280 nm雙通道分別檢測。

3.4 小結

潔白丸質(zhì)量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）[13]，含量測定指標僅為沒食子酸。筆者查閱文獻，針對潔白丸的研究多為臨床療效方面，未見采用其他指標成分對制劑質(zhì)量進行控制。本文所選擇的指標成分沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，是潔白丸處方中訶子、丁香、土木香多個藥味的有效成分[14-16]，并非來源于某單一藥味，故選取這4種成分進行檢測更能完全反映藥物的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗首次建立了一種快速、準確的HPLC-DAD雙通道分析方法，用于同時測定藏成藥潔白丸中4種活性成分（沒食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）的含量，與各成分單獨測定含量[17-19]比較，該方法分析時間更短、效率更高；同時，使用的有機溶劑消耗更少，在降低成本的同時還減少了環(huán)境污染[20]。該方法成功檢測了6批市售樣品，結果發(fā)現(xiàn)除現(xiàn)行標準已控制的指標成分沒食子酸結果較為穩(wěn)定外，其他3種成分測定結果最高值約為最低值的2～4倍（丁香酚：1.09～4.90 mg/g；土木香內(nèi)酯：0.25～0.60 mg/g；異土木香內(nèi)酯：0.30～0.72 mg/g），提示潔白丸現(xiàn)行質(zhì)量標準及生產(chǎn)工藝還需進一步完善，以便提高對丁香、土木香等揮發(fā)性藥味在制劑中的質(zhì)量均一性。本方法具有較好的精密度和準確度，方法學考察結果良好，可以為藏成藥潔白丸的質(zhì)量評價及標準制訂提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-05-21 修回日期：2018-07-17）

（編輯：余慶華）