過氧化氫對小鼠早期胚胎發育的影響

史河秀 劉玥 許頌華 王世鄂（通訊作者）

（1福建衛生職業技術學院基礎部 福建 福州 350101）

（2福建醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系 福建 福州 350004）

活性氧自由基（ROS），包括超氧陰離子自由基（O2·-）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH）等。在各種哺乳動物的早期胚胎發育過程中各種代謝和培養環境中都有可能產生過量ROS，導致氧化應激現象發生，可嚴重影響早期胚胎的發育[1]。我們選擇最常研究的1-細胞胚和8-細胞胚為研究對象，以H2O2誘導小鼠體外培養的早期胚胎的氧化損傷，探討哪個階段的早期胚胎對氧化損傷更為敏感，為后續優化培養體系、提高囊胚獲取率提供理論基礎。

1.材料與方法

1.1 實驗動物

昆明（KM）小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司（雌鼠4～6w，雄鼠8w以上），繼續飼養3～5d，調節生理周期，使其適應環境供實驗處理。

1.2 實驗方法

KM雌鼠腹腔注射10IU PMSG，48h后注射10IU hCG，隨后與KM雄鼠1:1合籠，次日清晨檢查陰栓判斷是否受精。分別于hCG注射后27h，從有陰栓雌鼠輸卵管中收集1-細胞胚；于hCG注射后66h，從有陰栓雌鼠輸卵管和子宮中收集8-細胞胚。經M2洗滌，KSOM培養液漂洗3次，挑取形態完好的1-細胞胚和8-細胞胚移至KSOM和H2O2處理微滴中，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中繼續培養30min，而后將早期胚胎細胞從微滴中移出，KSOM培養液分別洗滌3次，再移入預平衡好的KSOM培養微滴中繼續培養，于hCG后42h、66h（體外培養相對較體內發育速度慢，hCG后66h體外培養的多數處于4-細胞期，體內發育的多數為8-細胞期）、96h和120h觀察和記錄早期胚胎發育情況，每組重復3次以上。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0對實驗數據進行卡方檢驗統計分析，以P＜0.05為具有統計學意義。

2.實驗結果

表1 H2O2對KM小鼠1-細胞胚體外發育的影響

表2 H2O2對KM小鼠8-細胞胚體外發育的影響

KM小鼠1-細胞胚和8-細胞胚經不同濃度的H2O2（1-細胞胚處理濃度為20、30、40和60μM；8-細胞胚處理濃度為0、30、60、100和200μM）處理，與對照組相比，1-細胞胚處理組結果：20μM處理組，發育到2-8細胞階段的發育率差別無統計學意義，但囊胚發育率有統計學意義，其他組各階段發育率均有顯著差別，60μM處理組則發育完全阻滯；8-細胞胚處理組結果：30μM處理組其囊胚發育率差別沒有統計學意義，60μM處理組囊胚發育率仍有68.52%，200μM處理組發育完全阻滯。

3.討論

少量ROS在配子成熟、受精和胚胎發育過程中發揮著重要作用[4]。但是，ROS的過量產生，這可能誘導脂質過氧化，核DNA斷裂和線粒體改變等，從而影響植入前胚的發育。例如，Liu等研究顯示ROS蓄積使線粒體活性和結構改變而誘發胚胎發育阻滯[2]。在小鼠1-細胞胚中加入H2O2可誘導建立胚胎氧化損傷模型。本研究結果顯示：在1-細胞胚中加入20μM H2O2可引起囊胚發育率下降，60μM導致發育完全阻滯，也驗證了H2O2可誘導建立胚胎氧化損傷模型。

在8-細胞胚中，30μM處理組其囊胚發育率差別沒有統計學意義，60μM處理組囊胚發育率仍有68.52%，對桑椹胚的形成則幾乎沒有影響。實驗結果表明：體外培養小鼠早期胚胎對H2O2造成的氧化應激在1-細胞期比8-細胞期更為敏感。小鼠體外發育阻滯與小鼠合子型基因組激活緊密相關，1-2細胞胚正處于合子基因組激活時期，因而體外培養1-細胞胚只需較低濃度的H2O2即可引起細胞發育阻滯，而8-細胞胚時期，已完成母型-合子型過渡，這段時間內敏感性下降，因此需較高濃度的H2O2才會引起細胞發育阻滯。另外，有研究顯示多種抗氧化酶基因表達水平在小鼠胚胎2-細胞期均較低[3]，而在體外培養的小鼠早期胚胎發育過程中產生的ROS在2-細胞期時卻大幅度升高[4]，體外培養的1-2細胞胚承受較高的ROS而自身的清除能力卻不足，所以本研究增加少量H2O2即可誘發發育阻滯。本研究還發現隨著H2O2濃度的提高，發育阻滯主要發生于1-細胞到2-細胞的過渡，以及2-細胞到4-細胞的過渡，進一步證實小鼠早期胚胎發育阻滯可能與氧化損傷有關。因此，為了提高獲取率，我們可以對氧化損傷敏感的1-細胞胚和2-細胞胚為研究對象，進一步研究如何減少小鼠體外培養早期胚胎的氧化損傷以及如何抵抗氧化損傷，提高體外培養的囊胚獲取率。