青海地區產ESBLs大腸埃希菌基因型分析

蔣惠莉

（青海省西寧市第一人民醫院 青海 西寧 810000）

大腸埃希菌是醫院感染常見的致病菌，產生超廣譜β-內酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）菌株的出現，造成現存有效抗菌藥物失效，限制了治療方案的選擇。ESBLs具有多種耐藥基因，絕大多數定位于耐藥菌質粒DNA序列中，同一質粒還可同時攜帶多個耐藥基因，引起多重耐藥[1]。在世界各國及國內各地區ESBLs基因類型的分布并不完全相同，有相關研究報道，我國產ESBLs大腸埃希菌基因型以CTX-M為主[2]。為了解本地區產ESBLs大腸埃希菌的基因型特征，對產ESBLs菌株感染的預防、控制和治療提供更多的信息和依據，本研究檢測ESBLs的TEM、SHV和CTX-M型在青海地區的流行狀況。現將結果報道如下。

1.材料和方法

1.1 菌株

收集178株青海省內省、市、州、縣共5家醫院微生物實驗室臨床分離的產ESBLs大腸埃希菌。參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的紙片擴散表型確證方法[3]，篩選出產ESBLs大腸埃希菌菌株173株。質控菌株為ATCC 25922。

1.2 主要儀器及試劑

法國生物梅里埃VITEK2-compact鑒定藥敏系統、ABI steponeplus擴增儀、藥敏紙片（OXOID）、質粒提取試劑（上海生工）、擴增試劑（上海生工）、引物（上海生工合成）；DNA marker（上海生工）

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定和藥敏試驗 臨床樣本用法國生物梅里埃VITEK2-compact鑒定藥敏系統進行菌株鑒定及藥敏試驗。

1.3.2 表型確證 用NCCLS推薦的表型確證方法（雙紙片協同法）篩選出ESBLs菌株。

1.3.3 提取質粒 采用質粒提取試劑盒提取細菌質粒，嚴格按說明書操作。

1.3.4 PCR擴增[1]

引物：

TEM（P1：TATCCGCTCATGAGACAATA P2：AGAAGTGGTCCTGCAACTTT產物長度717bp）

SHV（P1：TCTCCCTGTTAGCCACCCTG P2：CCACTGCAGCAGCTGCCGTT產物長度593bp）

CTX-M-1（P1：ACGCTGTTGTTAGGAAGTG P2：TTGAGGCTGGGTGAAGT產物長度741bp）

CTX-M-2（P1：ACGCTACCCCTGCTATT P2：CAGAAACCGTGGGTTACGA產物長度829bp）

CTX-M-9（P1:AGTGCAACGGATGATGT P2:GGCTGGGTAAAATAGGTC產物長度774bp）

擴增反應參數 預變性 變性 退火 延伸 最后延伸溫度 94C° 94C° SHV 50C°，其余均55C°72C° 72C°時間 5min 45s 45S 1min 8min

PCR擴增體系（總體積50μl）：上、下游引物各2μl，DNA 模板 1μl， PCR Master 25μl，H2O 20μl

PCR擴增：在ABI steponeplus擴增儀進行擴增

1.3.5 PCR產物電泳及測序 采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，凝膠成像系統觀察結果，擴增產物由上海生工公司測序，測序結果在Gene Bank數據庫進行比較分析[1]。

2.結果

見表1、圖1

表1 大腸埃希菌檢出基因型別（株，%）

圖1 大腸埃希菌基因型別分布

3.討論

隨著科技的進步，越來越多的抗生素被發現，在救治感染患者的同時，抗藥性問題也隨之而來。近年來各類產ESBLs的菌株種類、數量及基因種類不斷增加，使抗感染問題更加困難[4-5]。了解本地區ESBLs基因型的特點，對醫院感染監測有重要作用，并可以為本地區流行病學提供數據。 據相關資料報道，浙江地區產ESBLs大腸埃希菌的基因型以CTX-M-14型為主[6]。天津市以SHV型、TEM型、CTX-M-1型、CTX-M-9型為主[7]。通過本次研究，青海地區產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌主要流行基因型別以CTX-M型為主，其次為TEM型。CTX-M型亞型中以14型、55型和15型為主，還有少量的27型、24 型、3型、64型及123型存在。TEM型以TEM-1為主。本實驗173株菌中攜帶耐藥基因菌占73.99%，其中只攜帶一種基因型菌株占53.17%，同時攜帶多種基因型菌株占20.8%，這說明本地區耐藥基因攜帶菌株比例大，同時攜帶多基因菌株也較多，這對耐藥菌治療及控制其蔓延提出了更高要求。我們必須重視臨床合理用藥，加強感染控制，防止多重基因型ESBLs菌的播散。