不同海拔高度牛宰后牛肉AMPK活性及能量代謝研究

楊雅媛 宋仁德 韓 玲 高永芳 余群力 馬君義

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070； 2.青海省玉樹州畜牧獸醫工作站， 玉樹 815000； 3.青海百德投資發展有限公司， 西寧 810008)

0 引言

青海玉樹牦牛主要生長在平均海拔4 500 m左右的高山草原，其空氣含氧量僅為海平面的50%[1-2]，甘肅甘南牦牛主要分布于海拔3 000 m左右的甘南草原，甘肅張掖地區的西門塔爾牛×秦川牛(西雜牛)主要生活在約1 500 m的農區。本課題組前期研究發現，與低海拔地區的牛肉相比，高海拔地區牛肉中糖酵解強度增加，是由于牦牛為適應高原環境而產生高原適應現象，通過增加糖酵解來維持三磷酸腺苷(ATP)的產生[3-5]。研究表明，牦牛機體中存在適應低氧環境的特有代謝機制，以達到低氧條件下的能量供求平衡，其中5′-一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作為重要的細胞能量傳感器，在調節能量代謝和肉質中起重要作用[6-9]。

低氧條件下，機體處于應激狀態，代謝加強，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的5′-一磷酸腺苷(5′-AMP)和AMPK的γ-亞基相互作用，激活AMPK[9]。DING等[10]對3種不同海拔高度牦牛中乳酸脫氫酶(LDH)活性研究顯示，該酶與海拔高度呈正相關關系，LDH是無氧糖酵解的關鍵酶，更高海拔的牦牛更加依賴能量代謝供應。LIN等[11]通過對牦牛與平原肉牛背最長肌中LDH活性比較發現，LDH在牦牛中表現出更高的酶活力，與平原肉牛相比，牦牛背最長肌更傾向于糖酵解代謝。SHEN等[12]對3種不同海拔高度豬種糖酵解潛力進行了研究，結果表明，與平原品種相比，較高海拔品種具有較低的能量代謝水平。因此，有必要對不同海拔高度、低氧環境下能量代謝及AMPK活性的變化進行進一步研究。本文研究不同海拔高度牛宰后牛肉成熟過程中AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表達量、AMPK活力對糖酵解以及能量代謝的影響，為建立宰后牦牛肉能量代謝理論體系奠定基礎。

1 材料儀器與試驗方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：玉樹牦牛樣本采自青海省玉樹藏族自治州(海拔4 500 m左右)，甘南牦牛樣本采自甘肅省甘南藏族自治州(海拔3 000 m左右)，西門塔爾雜交牛樣本采自甘肅省張掖地區(海拔1 500 m左右)，選取生長發育正常、健康無病、平均年齡2～4歲，體質量(200±20)kg，雌雄各半的3類樣本各10頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。屠宰后立即取牛胴體中部背最長肌肉樣，置于0～4℃環境下。

試驗試劑：RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)，Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RNA逆轉錄試劑盒)，SYBR Premix Ex TaqTM II(染料法熒光定量試劑盒)，pMD 19-T Vector Kit(逆轉錄試劑盒)，大連寶生物工程有限公司；RNase-free水， 北京天根生物技術有限責任公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，康寧生命科學(吳江)有限公司；Trans1-T1感受態細胞，北京全式金生物技術有限公司；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)酶聯免疫檢測試劑盒，乳酸測定試劑盒，肌/肝糖原測定試劑盒，游離葡萄糖(Glu)，ATP含量測定試劑盒，ADP含量測定試劑盒，AMP含量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；Tris-HCl，D-mannitol(D-甘露糖醇)，美國Amresco公司；EDTA，EGTA，美國Sigma公司；DTT，德國Merck公司；NaF(焦磷酸鈉)，天津永大化學試劑廠；濃硫酸，NaCl，國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Eppendorf 5417R型低溫臺式冷凍離心機，德國Eppendorf生物公司；CFX96型實時定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BG-power 3500型穩壓穩流電泳儀、水平電泳槽，北京百晶生物技術有限公司；Biometra PCR擴增儀，北京北方華奧貿易有限責任公司；凝膠成像分析系統，美國BIO-RAD公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LRH-250型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品采集和制備

以上述背最長肌(Longissimusdorsi)為試驗材料，每頭分別取40 g肉樣，立即放入液氮中，用于0 h樣品，以及AMPK活力、糖酵解指標、能量代謝等指標進行的測定。

將其余背最長肌肉樣每塊迅速切成40 g，于4℃條件下，分別成熟12、24、72、120、168 h，在相應時間點測定pH值，以及進行AMPK活力、糖酵解指標、能量代謝等指標的測定。同時，將肉樣在設計時間點用液氮迅速冷凍，置于-80℃待測。

宰后1 h內取其背最長肌切成約100 mg的小肉塊，立即放入無酶無菌凍存管中，液氮中冷凍，置于-80℃，用于對AMPK基因表達量的測定。

1.3.2AMPK活性測定

取樣品約0.3 g，按照料液比5 mL/g加入保存于4℃冰箱的冷凍勻漿液，在3 000 r/min的條件下冰浴勻漿，每次勻漿12 s，間隙30 s，連續5次。然后在4℃、10 000 r/min的條件下冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。AMPK活力的測定步驟以及計算結果參照試劑盒說明書進行。

1.3.3AMPK基因表達量的測定

總RNA的提取及反轉錄：參照文獻[13]對肌肉中總RNA進行提取。RNA樣品于-80℃冰箱中保存。利用反轉錄試劑盒合成cDNA。按Trizol Reagent試劑盒要求提總RNA；用反轉錄試劑盒對 RNA 進行反轉錄[14]。

引物序列來源及合成：PRKAA1、PRKAA2基因引物序列參照馬曉冰[15]的設計。

實時定量PCR擴增：本試驗按照CFX96型實時熒光定量PCR的二步法進行操作。以所合成的cDNA為模板，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進行實時定量PCR擴增[16]，見表1。

表1 用于實時熒光定量PCR的引物序列及PCR參數Tab.1 Primer sequences and parameter used for real-time quantitative PCR

基因相對表達量的計算：試驗采用文獻[17]的方法對實時定量PCR數據進行處理和分析，數據用平均值±標準誤差表示，均值差異顯著性采用One-Way ANOVA統計。采用SPSS 19.0進行相關性分析。

1.3.4糖酵解指標的測定

將pH計的探針插入肉樣中，使pH計的電極與肌肉組織充分接觸，讀數穩定后記錄，每個肉樣重復測定3次，取平均值。

肌糖原、乳酸、游離葡萄糖含量采用南京建成試劑公司的試劑盒進行測定，試驗具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明進行。

1.3.5能量代謝指標的測定

參照ATP、ADP、AMP含量測定試劑盒說明書測定其摩爾質量濃度，用雙縮脲法測定樣品的蛋白含量。

1.4 數據統計分析

試驗結果均采用平均值±標準差表示，數據均平行測定3次，用SPSS 19.0軟件進行方差分析，用Origin 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 AMPK活性

AMPK活性會受到運動、缺氧、缺血、應激等多種因素的影響[13，15-16，18]，成熟過程中AMPK活力變化如圖1所示，圖中小寫字母表示同一海拔高度牛肉在成熟過程中指標的差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示不同海拔高度牛肉在每個成熟時間點指標的差異顯著(P<0.05)，下同。缺氧條件下，西雜牛AMPK活力均低于甘南牦牛和玉樹牦牛，可能是由于牦牛在低氧條件下，機體處于應激狀態，代謝加強，ATP消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的AMP激活AMPK。AMPK能夠調節動物機體糖代謝，當AMPK活化以后可以通過促進糖酵解和糖原分解來提高細胞的ATP水平，抑制糖原合成和糖異生來阻止ATP的消耗[19]，從而增加ATP含量以維持機體能量代謝平衡。

圖1 成熟過程中AMPK活力的變化Fig.1 Changes of AMPK activity during conditioning time

2.2 基因表達量

如圖2所示，玉樹牦牛PRKAA1基因(α1)的表達量與西門塔爾雜交牛和甘南牦牛相比差異不顯著，甘南牦牛和玉樹牦牛PRKAA2基因(α2)表達量顯著大于西門塔爾雜交牛(P<0.05)。AMPK在應激情況下對調節細胞代謝，維持細胞內環境的穩定有重要作用。AMPK α是最為重要的催化亞基，主要分布在骨骼肌、肝臟和心臟，它出現缺陷或活性降低會直接影響機體能量調節功能，α2亞基在骨豁肌中的表達要高于α1亞基，含量占總AMPK的80%以上，并且α2亞基有更強的催化效力[17]。當機體處于代謝應激時，AMPK往往被激活，活化的AMPK能促進外周組織攝取和利用血糖，從而糾正能量代謝的失衡，維護細胞和整體代謝穩態的穩定，因此AMPK α2亞基對宰后糖酵解過程起到主要調節作用。

圖2 AMPK α亞基基因表達水平Fig.2 Gene expression of α subnits of AMPK

2.3 宰后糖酵解指標

pH值的下降主要是由屠宰后乳酸的增加引起的[14]。由表2可看出，剛屠宰時，牛肉的pH值均在6.5～7.0之間，屠宰后由于胴體氧氣供應中斷，糖原進行無氧糖酵解產生乳酸，ATP分解后生成磷酸，乳酸、磷酸使肉的pH值下降。但不同種類的動物肌肉在成熟過程中，pH值下降速度存在差異。玉樹牦牛、甘南牦牛和西門塔爾雜交牛成熟至72 h，pH值達到其極限值，此時pH值在5.53～5.58之間。

在3種海拔高度基因型中，背最長肌的糖原和乳酸含量分別如表2所示。成熟過程中糖原含量快速下降，乳酸含量在宰后24 h前迅速增加(P<0.05)，但宰后72 h的變化速率降低，后趨于穩定。玉樹牦牛和甘南牦牛是適應低氧水平和寒冷環境的高海拔品種，有特殊的糖酵解特征。為了適應寒冷、高海拔的環境，玉樹牦牛和甘南牦牛必須有足夠的能量供應來維持體溫。無氧代謝(糖酵解)效率低下，每個葡萄糖分子僅產生2個ATP分子，而完全氧化代謝產生38個ATP分子[20]。因此，玉樹牦牛和甘南牦牛必須提高能量產生的效率，從而可以誘導高海拔品種增加氧化代謝和減少無氧代謝[21]。影響宰后糖酵解變化的主要因素有糖原含量，糖原影響游離葡萄糖的含量，通過糖酵解將游離葡萄糖分解成乳酸[22]。為了更好地了解糖酵解差異，進一步研究了宰后游離葡萄糖含量(表2)。宰后西雜牛總體游離葡萄糖含量高于玉樹牦牛和甘南牦牛。與此同時，宰后成熟過程中游離葡萄糖的含量并沒有出現劇烈的上升和下降。根據結果表明，當糖酵解底物含量足夠時，糖原合成和分解不是影響乳酸含量進而改變肉質的關鍵因素，因此該機制解釋了不同品種的肉質差異，僅與葡萄糖通過糖酵解分解成乳酸的過程有關。

表2 宰后牛肉成熟過程中糖酵解指標變化Tab.2 Change of yak skeletal muscle quality during conditioning time

隨著宰后成熟的進行，ATP逐漸耗盡，肌肉缺少能量控制，肌肉組織開始失控瓦解，解僵開始[23]。在低氧條件下，機體處于應激狀態，代謝加強，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的5′-AMP和AMPK相互作用，激活AMPK[1,24]。AMPK激活的過程中伴隨ADP、AMP含量的降低。如表3所示，不同海拔高度牛肉宰后ADP的消耗總體都呈現顯著的下降趨勢(P<0.05)，低海拔的西雜牛ADP含量始終較高。

3 結束語

通過測定玉樹牦牛(海拔4 500 m)、甘南牦牛(海拔3 000 m)和西門塔爾雜交肉牛(海拔1 500 m)宰后成熟過程中牛肉AMPK活性、AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表達量、糖酵解和能量代謝的變化可以得出，高海拔地區AMPK的活性高于低海拔地區，并且高海拔地區條件下PRKAA1和PRKAA2基因表達量均高于低海拔條件下。這說明PRKAA1以及PRKAA2基因表達量升高會使AMPK的活性增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路，使糖酵解活性增加，從而促進糖酵解進程，產生大量乳酸，進而導致宰后動物肌肉的能量代謝降低。因此，高海拔、低氧適應性下牛肉AMPK的活性增加，從而加快糖酵解代謝，有效調節能量的生成，為建立宰后牦牛肉能量代謝理論體系奠定了一定基礎。

表3 宰后牛肉成熟過程中能量代謝指標變化Tab.3 Change of yak skeletal muscle energy metabolism during conditioning time mmol/g