山西省杜鵑花屬植物親緣關系的RAPD分析

張哲瑋，邢國明

（1.晉中市林業局，山西晉中030600；2.山西農業大學，山西太谷030801）

杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（RhododendronL.）植物在全球約有960種[1]，許多種類色彩鮮艷，是園藝觀賞的重要品種，部分種類的花、葉、根具有藥用和工業價值[2]。山西省野生杜鵑花屬植物僅有照山白（Rhododendron micranthum）和迎紅杜鵑（Rhododendron mucronulatum）[3]，對野生杜鵑的引種選育既可豐富山西省杜鵑花的多樣性，還可綜合開發帶來經濟效益。

RAPD（Random amplified polymophic DNA）是由WILLAMS等提出的一種檢測DNA多態性的分子標記技術[4]，其特點是所需DNA用量少、對DNA的純度要求不高、不涉及放射性同位素、程序簡單、靈敏度高、多態性豐富[5-7]，在植物種質資源品種鑒別、親緣關系分析方面應用廣泛。

植物育種的關鍵是正確選擇親本材料，如果親本的遺傳基礎狹窄，將難以培育出優良的新品種。杜鵑花屬植物種類繁多，相似品種用傳統分類學區分困難。因此，分析杜鵑花屬植物的親緣關系，對于杜鵑花的選育具有重要的指導意義。目前，已有學者陸續采用分子標記技術研究杜鵑花的親緣關系，但大多集中在杜鵑花分布廣泛的地區[8-10]，山西省有關杜鵑花的分子標記尚未開展。

本研究運用RAPD技術，分析山西省2種野生杜鵑和6個常見的引進品種的親緣關系，旨在為山西省杜鵑花的分類鑒定和遺傳育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試11份樣品采集自山西省不同區域，照山白和迎紅杜鵑從野外采集，6個園藝品種分別由晉中市和太原市苗圃提供（表1）。選取植株嫩葉放入硅膠密封干燥，-20℃保存[11-12]。

表1 供試材料及其地理信息

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取及檢測 選取一個樣品分別采用CTAB法[13]與核沉淀法[14]提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量（圖1），比較之后確定使用核沉淀法。用微量紫外/可見分光光度計（Nanodrop ND-1000）檢測所提DNA的濃度及純度，并最終稀釋成20 ng/μL，4℃保存備用。

1.2.2 引物篩選 隨機抽取3個樣品的DNA，對50條引物進行篩選，將能擴增出條帶的引物進行二次篩選，依據電泳結果，挑選擴增條帶清晰、多態性豐富的引物用于杜鵑花的親緣關系研究。

1.2.3 建立RAPD-PCR體系 PCR擴增程序參照周蘭英等[15]的方法，即94℃預變性4 min；94℃變性 30 s，36℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，共 45個循環；最后72℃延伸10 min，產物于4℃保存。

RAPD-PCR反應體系[16]經優化確定為：20μL反應液中包括 2 μL 模版 DNA，0.3 μL Taq DNA 聚合酶（5 U），2 μL 10×buffer（2 mmol/L含Mg2+），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.2 μL 引物 （20 U），13.3 μL ddH2O。

1.2.4 擴增產物檢測 擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，使用自動凝膠成像系統拍照，并記錄數據。

1.3 統計分析

根據電泳圖上擴增譜帶的有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，將得到的1-0矩陣用NTSYS軟件處理，以Nei-Li公式計算遺傳相似系數。

其中，GS為遺傳相似系數，Nij為樣品i和j共有的擴增片段數，Ni和Nj分別代表樣品i，j的擴增片段數目。

按照非加權成對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析[17-19]。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

從50條引物中選出4條引物（表2），擴增出的條帶清晰，重復性和多態性均較好（圖2），符合分子標記對擴增條帶的要求。

表2 試驗篩選出的引物

2.2 擴增產物多態性分析

用篩選出的4條引物對11個供試樣品進行RAPD-PCR擴增，由圖3，4可知，共擴增出44條DNA條帶，其中，多態性條帶數28條，多態位點率63.64%，平均每個引物擴增譜帶11條，說明杜鵑花屬植物在分子水平上多態性是比較豐富的。通過分析，5個亞屬中都存在本亞屬特有的共有譜帶，分別為杜鵑亞屬3條、迎紅杜鵑亞屬2條、馬銀花亞屬2條、羊躑躅亞屬1條、映山紅亞屬3條，擴增結果在一定程度上體現了各亞屬的特性。

2.3 親緣關系分析

表3 8種杜鵑（11個樣品）的相似系數

將統計的1-0數據用NTSYS軟件處理，計算得出各樣品間的遺傳相似系數（GS）。由表3可知，11個樣本間的GS在0.238 8～0.970 2，平均值為0.540 6，說明各樣本間遺傳基礎差異較大。照山白與迎紅杜鵑的GS最小，為0.238 8，說明親緣關系最遠；最大GS為0.970 2，在照山白樣本間產生，表明同種杜鵑在不同地域上仍有很高的同源性；刺毛杜鵑與馬銀花之間的GS為0.850 8，錦繡杜鵑與皋月杜鵑之間的GS為0.880 6，表明同一亞屬間的品種親緣關系較近；迎紅杜鵑與羊躑躅為不同亞屬，GS卻高達0.850 8，表明二者在形態學上雖有一定差異，但遺傳背景卻有很高的同源性。

2.4 聚類結果分析

用UPGMA方法對8種杜鵑花（11個樣品）進行聚類分析，結果如圖5所示，11個樣品在遺傳相似系數（GS）為0.78附近被劃分成3大類群，第1類群為3個照山白樣品，屬杜鵑亞屬；第2類群中，迎紅杜鵑與羊躑躅、刺毛杜鵑與馬銀花在GS為0.85處先聚為2組，隨后聚為一類；第3類群為滿山紅、錦繡杜鵑和皋月杜鵑，同屬映山紅亞屬。第2，3類群在GS為0.64處聚類后，在GS為0.33處與第1類群最終聚為一類，聚類結果與形態學分類相吻合。

3 討論與結論

分子標記技術能快速準確地對植物材料進行鑒別，其中，RAPD，AFLP[20]等技術更便于進行植物的遺傳多樣性分析。RAPD標記作為以PCR為基礎的分子標記，具有所需DNA用量少、對模板DNA的純度要求不高、不涉及放射性同位素、程序簡單、靈敏度高、多態性豐富的優點。本研究應用RAPD標記對試驗材料間的親緣關系進行分析，通過優化PCR反應體系，提高了試驗的穩定性和重復性。

本試驗使用從50條引物中選出的4條引物，對8種杜鵑花進行擴增，共得到44條清晰條帶，其中，多態性條帶28條，多態位點率63.64%，4條引物能夠較好地將供試材料區分開，表明RAPD標記對杜鵑花的遺傳多樣性分析是可行的。

用Nei-Li公式計算經NTSYS軟件處理的統計數據，得出遺傳相似系數（GS）在0.238 8～0.970 2，平均值為0.540 6，表明這8個品種具有較豐富的遺傳多樣性。UPGMA聚類結果顯示，在不同遺傳相似系數上，8個品種可分為多個亞屬，在GS為0.78附近，11份供試材料劃分成3大類群，第1類群的照山白屬于杜鵑亞屬照山白亞組，與其他樣品的GS均在0.42以下，說明與其他品種間的親緣關系較遠，原因可能是照山白的形態和習性與其余供試品種有較大差異；第2類群為迎紅杜鵑、羊躑躅、刺毛杜鵑和馬銀花，分別屬于迎紅杜鵑亞屬、羊躑躅亞屬和馬銀花亞屬（刺毛杜鵑、馬銀花），4個品種在形態學上差異明顯，但在基因水平上具有很高的同源性，特別是迎紅杜鵑和羊躑躅，不同亞屬的GS達到了0.850 8，這與杜鵑花在長期進化過程中基因交流頻繁，且屬異花授粉植物有關[21]。第3類群為滿山紅、錦繡杜鵑和皋月杜鵑，同屬映山紅亞屬，表明同一亞屬間的品種親緣關系較近。

杜鵑花的新品種選育一直都是通過形態學分析測試來鑒定和選擇親本，隨著分子標記技術的發展，可在分子水平上快速準確的分析親緣關系，選擇出遺傳多樣性豐富的親本。本研究運用RAPD技術，對8個品種的杜鵑花進行了親緣關系分析，試驗結果可為山西省杜鵑花的分類鑒定和遺傳育種提供分子水平的理論依據。