刺茶美登木抑菌活性成分研究

劉彥超，黑育榮，田 進

（楊凌職業技術學院，陜西楊凌712100）

衛矛科（Celastraceae）植物有著悠久的民間藥用資源歷史。衛矛科美登木屬（Maytenus）植物，全球共有300多種，分布在我國的有20種左右[1]，該屬植物富含三萜[2-3]、倍半萜[4]、生物堿[5-6]、黃酮及其苷類[7-8]、酚類[9]等。在民間，美登木屬植物被廣泛用作抗敗血病、抗腫瘤、抗炎、催涎、治療消化道疾病、哮喘、風濕、類風濕等疾病的藥物[2-5，10]。

美登素，從結構上看屬于大環內酯類，作為一種天然抗腫瘤活性成分，其在20世紀70年代被發現，吸引了科研工作者對美登木屬植物活性成分的研究，如布昌南美登木（Maytenus buchananii）[7]、云南美登木（Maytenus hookeri）[8]、細梗美登木（Maytenus graciliramula）[9]、廣西美登木（Maytenus guangsiensis）[10]、密花美登木（Maytenus confertiflorus）[11-12]、刺茶美登木（Gymnosporia varialilis）[13]等，取得了重要的研究進展。隨著美登素的廣泛臨床使用，其副作用也逐漸呈現出來，一系列的不良反應致使對美登素的相關研究工作也一度停止。20世紀90年代之后，由于美登木屬植物表現出顯著的抗菌、昆蟲拒食活性、抗炎、抗HIV等多方面的生物活性，重新進入了科研工作者的視野。

MONACHE等[14]于 1984年從 Maytenus rigida中分離到顯示昆蟲拒食作用的生物堿類化合物，以此為開端，有關美登木屬植物中昆蟲拒食活性成分陸續被報道[15-17]。近年來，隨著美登木屬植物化學成分及生物活性相關研究工作的深入，新的化學結構類型和具有多種生物活性的先導化合物不斷被發現，如細胞毒[11]、HIV-1 蛋白酶抑制[8]、抗炎[12]等方面的活性。

李炳鈞等[13]于1983年從刺茶美登木（Gymnosporia varialilis）中分離出3個生物堿類化合物，分別是美登普林（maytanprine）、美登新（maytansine）和美登布?。╩aytanbutine），活性測試結果顯示，其均具有強烈的抗癌活性。

2005年，中國科學院成都生物研究所對它的乙醇提取物進行活性篩選后發現，它具有血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性，為了闡明刺茶美登木提取物中具有ACE抑制活性的物質，對其地上部分的95%乙醇提取物進行了系統地分離，從中共分離純化并鑒定了30個化合物，其中，（+）-兒茶素和咖啡酸是抑制ACE的活性成分[18]。

本研究對刺茶美登木的乙醇提取物進行抗菌活性篩選，發現了它具有抑制油菜菌核、小麥雪腐、小麥根腐、水稻白葉枯、白菜軟腐、獼猴桃潰瘍生長的活性。并采用活性跟蹤法對提取物進行了分離純化，最終獲得2個化合物，即Tanegool和Prinsepiol，其中，化合物Tagenool具有較強的抑菌活性。本研究旨在為將刺茶美登木開發成植物源殺菌劑奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

刺茶美登木地上部分采自四川省攀枝花市，標本由西北農林科技大學生命科學院李琰副教授鑒定，憑證標本（標本號No.P-22）保存在楊凌職業技術學院標本室。

1.2 供試菌種

煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、楊樹潰瘍病菌（Dothiorella gregariaSacc.）、棉花枯萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）、 水 稻 紋 枯 病 菌（Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk.）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae（Berk.）Sacc.）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealisVander Hoeven）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病菌（Bipolaria maydis）、番茄早疫病菌（Alternaria solani（Ellis et Martin）Jones et Grout.）、黃瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum Schlecht）、棉花黃萎病菌（Verticilliumdahliae）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata（Stoneman）Spauld.et Schrenk）、番茄葉霉病菌（Fulvia fulva（Cooke）Ciferri）、番茄灰霉病菌（Botrytiscirerea Pers Fr.）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）、棉花立枯病菌（Rhizoctoniasolani）、小麥赤霉病菌 （Gibberella zeae（Schw.）Petch）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeriaberengriana f.sppiricola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsiciLeonian）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzaeCav.）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、小麥白粉病菌（Blumeriaa graminis）、小麥根腐病菌（Bipolarissorokiniana）。以上菌種均由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供。

1.3 培養基

馬鈴薯瓊脂培養基（PDA培養基）：將洗凈后的土豆去皮并切片，于鍋中加1 000 mL水和200 g已切好的土豆片，燒開后保持沸騰約30 min，之后用紗布過濾，再加適量的水將濾液補足至1 000 mL，并倒入干凈的鍋中，再加入10 g瓊脂和20 g葡萄糖，再次煮沸，待瓊脂和葡萄糖全部溶解后，停止加熱，趁熱將培養基分裝于250 mL的三角瓶中，封口，于滅菌鍋中滅菌30 min（121℃）。

1.4 主要儀器與試劑

旋轉薄膜蒸發儀（上海申生科技有限公司，W501B）；超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB25-12DT）；干燥箱（北京化玻聯醫療器械有限公司，科偉101-1）；粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司，F-160）；循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司，SHB-B95A）；全自動型鼓風干燥箱（上海智域分析儀器制造有限公司，ZRD-5030）；三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠，ZF-2）；玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市莫峪予華儀器廠，KQ-C）；薄層板（自行鋪制的25 mm×75 mm及50 mm×100 mm的薄層板）；各種規格的層析柱；工業純試劑：95%工業乙醇、石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等試劑；分析純試劑：石油醚、丙酮等試劑；硅膠：0.15～0.18（拌樣硅膠），0.049～0.075 mm（柱層析硅膠），GF-254型薄層層析硅膠；顯色劑為10%硫酸乙醇顯色劑和碘顯色劑等。

1.5 方法

1.5.1 活性物質的提取分離純化 在活性跟蹤的基礎上采用有機溶劑萃取、反復柱層析、重結晶等技術對刺茶美登木中的抗菌活性成分進行分離純化。

1.5.2 活性物質的結構鑒定 采用波譜學方法對單體化合物進行結構鑒定。

1.5.3 抑菌活性測定 抑制菌絲生長速率法：采用抑制菌絲生長速率法測定刺茶美登木95%乙醇提取物對植物病原真菌的離體活性。把95%乙醇提取物配制成待測供試藥液（溶劑為分析純丙酮），將供試藥液與已融化的培養基按1∶9（V∶V）的比例混合均勻，倒入直徑為9 cm的培養皿內，制成帶毒平板，以溶劑為空白對照。用打孔器（直徑為4 mm）將病原真菌打成大小一致的菌餅，接入帶毒培養基的中央，每皿接1個菌餅，設3個重復，將轉接過的菌種置于28℃的培養箱中培養3～7 d，之后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5.4 提取物初步活性測定 將粉碎后的刺茶美登木植物樣品的95%乙醇提取物減壓蒸干后配成500 mg/mL的丙酮溶液，置于4℃冰箱中冷藏，使用前稀釋到所需濃度即可。以丙酮處理為對照，設置3個重復，按1.3.3方法對供試植物病原菌進行菌絲生長速率抑制率的測定。

1.5.5 活性物質的分離與純化 自然風干并粉碎后的刺茶美登木（G.varialilis）的全草（1 kg）在室溫下用95%工業乙醇浸泡21 d（每次7 d，共3次，5 L×3），合并總浸出物，采用減壓濃縮得到總浸膏共40 g。將總浸膏分散于1.5 L的50℃熱水中，依次用石油醚（1.5 L×5）、乙酸乙酯（1.5 L×5）萃取，萃取液分別濃縮得浸膏A（石油醚萃取物，6.4 g）、B（乙酸乙酯萃取物，8 g）和C（水相，未稱質量）?？咕钚陨餃y定結果表明，乙酸乙酯萃取物B顯示出較強的活性，因此，對乙酸乙酯萃取物進行了進一步的分離純化，以石油醚-丙酮（10∶1）為洗脫劑進行硅膠柱層析（柱長30 cm，內徑5 cm），通過TLC分析合并得到5個組分BA1～BA5，其中，BA2為活性部位。BA2放置1 d后有白色針狀晶體析出，經過重結晶處理，得到化合物2。BA2的母液進一步采用硅膠柱層析進行分離，并結合制備TLC和重結晶技術，得到化合物Tanegool。

1.5.6 活性物質的結構鑒定 經TLC檢驗，在石油醚∶丙酮（10∶1），氯仿∶丙酮（20∶1）和氯仿∶甲醇（50∶1）3種展開體系中，化合物Tanegool和Prinsepiol均為單一斑點；經熔點測定，Tanegool和Prinsepiol的熔點分別為138.2～140.1，122.2～123.4℃，熔點尖銳，熔程短。

根據以上檢驗結果，初步判斷化合物Tanegool和Prinsepiol均為純品。與已知標準品進行TLC多體系對照，Rf值均保持良好的一致性，通過核磁共振氫譜和碳譜（1H-NMR，13C-NMR）最終鑒定這2種化合物分別為Tanegool和Prinsepio（l結構式如圖1所示）。

1.5.7 活性成分梯度活性測定 將化合物Tanegool配制成 5 個濃度梯度 1.00，0.80，0.60，0.40，0.20 mg/mL，以丙酮處理為對照，設置3個重復，按1.3.3方法對油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌3種植物病原菌進行菌絲生長抑制活性測定。8 d后測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 刺茶美登木95%乙醇提取物對植物病原真菌的抑制活性

從表1可以看出，刺茶美登木95%乙醇提取物在質量濃度為10 mg/mL時，對油菜菌核病菌、番茄早疫病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用較強，抑制率在75%以上，對蘋果輪紋病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌表現出一定程度的抑制活性，抑制率在40%～75%，對白菜黑斑病菌、蘋果炭疽病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、棉花黃萎病菌和小麥紋枯病菌的抑制率均在20%以下。

表1 刺茶美登木95%乙醇提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用

2.2 單體化合物對供試病原菌的抑制活性

刺茶美登木95%乙醇提取物依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取后得相應浸膏，對抑菌活性較強的乙酸乙酯萃取段進行反復柱層析，并結合重結晶處理，獲得2個單體化合物。通過TLC檢驗、熔點測定，并結合1H-NMR和13C-NMR波譜數據，分別鑒定為Tanegool和Prinsepiol。測定了化合物Tanegool和Prinsepiol對以上植物病原菌菌絲生長抑制作用。從表2可以看出，當質量濃度為1 mg/mL時，化合物Tanegool對油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用，而化合物Prinsepiol在同樣的濃度下，對番茄早疫病菌有一定的抑制作用，對其余植物病原菌抑制效果較弱，甚至不表現出活性。圖2顯示的抑菌圈大小也驗證了化合物Tanegool對以上3種植物病原菌菌絲生長的抑制作用強弱。

表2 Tanegool和Prinsepiol對幾種植物病原真菌的抑制活性

2.3 不同濃度的Tanegool在對植物病原真菌菌絲的生長抑制

由表3可知，Tanegool對3種植物病原菌的抑制效果與濃度呈正相關。質量濃度為1 mg/mL時，對西瓜枯萎病菌的抑制率最高，可達到質量濃度為0.2 mg/mL時的6倍，最低為3.33倍，這表明，對植物病原真菌菌絲的生長作用表現出濃度依賴性。

表3 Tanegool在不同濃度下對植物病原真菌的抑制作用

3 結論

本研究通過對刺茶美登木乙醇提取物的抑菌活性成分進行跟蹤分離，獲得2個化合物（Tanegool和Prinsepiol），在質量濃度為1 mg/mL時，Tanegool對油菜菌核病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有較好的生長抑制作用，對西瓜枯萎病菌效果尤為明顯。Prinsepiol未表現出活性。

另外，Tanegool對以上3種植物病原菌的抑制作用呈現出濃度依賴性，各濃度間對植物病原菌的抑制作用有的差異很大，有的無顯著差異，其對真菌的抑制作用強度值得進一步驗證。

經過結構解析，Tanegool和Prinsepiol都屬于木脂素類化合物，此類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、保護肝臟、抗氧化、血小板活化因子拮抗活性、抗炎抗菌等作用[19-20]。如西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心從砂地柏中提取的木脂素類化合物鬼臼毒素具有拒食殺蟲活性；KAWAZOE等[21]從馬鞭草科蔓莖植物的果實中分離得到4種抗菌活性的木脂素vitrofolal B，C，D，E。據文獻報道，刺茶美登木中含有多種木脂素類化合物，此次研究發現，Tanegool具有較高的抑制植物病原真菌菌絲生長的活性?；衔颬rinsepiol雖然在本試驗中顯示較弱的抑制植物病原菌活性，但其在該植物中含量較高，若能對其進行簡單結構改造以提高活性，將對刺茶美登木作為原料開發植物源殺菌劑具有重要的意義。

本研究結果為進一步發現刺茶美登木殺菌活性成分提供了一定的參考，為將刺茶美登木開發成植物源殺菌劑提供了一個良好的開端。