呂梁山乳菇屬常見物種的分子鑒定及資源評價

劉 虹 ，李素玲 ，董淑英 ，楊 杰 ，許 晶 ，郭福貴

（1.山西省農業科學院食用菌研究所，山西太原030031；2.忻州市科技局，山西忻州034000；3.寧武縣農業委員會，山西寧武036700）

乳菇屬（LactariusPers）是北溫帶地區最重要的與許多森林建群樹種形成外生菌根的真菌類群之一，其中包括多種世界范圍內廣受歡迎的野生菌貿易種類。乳菇屬因受傷時菇體多會流出乳汁狀液體而得名。真菌分類學上，乳菇屬隸屬于紅菇目Russulales紅菇科Russulaceae。《真菌辭典》第10版[1]顯示，該屬大約有450種，而IndexFungorum（http://www.speciesfungorum.org/）上收錄的有超過1 500個名稱，是北半球蘑菇中最大的家族之一。研究顯示，乳菇屬是地球上已知最重要的專一性外生菌根菌類群之一[2]，它們和北溫帶地區許多重要的森林建群樹種形成菌根，如多種松樹Pinusspp.、云杉Piceaspp.、橡樹Quercusspp.、樺木Betulaspp.等，構成森林生態系統的基本生物類群。乳菇屬大部分種類可以食用，有些種類是世界范圍內著名的食用菌，如松乳菇Lactarius deliciosus、云杉乳菇Lactarius deterrimus等。雖然有幾個種類被認為有毒，但本屬沒有致死的物種[3]。有資料記載，山西乳菇屬物種有6種，其中報道產于呂梁山針葉林中的有3種，即紅汁乳菇、辣味乳菇和窩柄黃乳菇[4]。呂梁山位于山西省西部，大體為西南—東北走向，高海拔地區生長有大面積的云杉、落葉松天然次生針葉林，低海拔地區則生長有大量的油松林，是山西省最大的林區。從北向南依次有蘆芽山、關帝山、五鹿山等3個國家級自然保護區，區內生態系統完整，氣候類型跨越寒溫帶、溫帶、暖溫帶，森林覆蓋率較高，是研究山西省菌類物種多樣性和生態環境多樣性的理想地區。過去已有涉及該地區真菌物種分類和資源等方面的研究[4]，但研究手段以傳統形態學為主，由于真菌物種個體的形態有時會因環境不同而改變，以及不同的發育階段會有不同的特征表現等，因而不可避免地導致了一些物種的錯誤鑒定[5]。

本研究首次采用DNA分子技術，對呂梁山地區針葉林內的重要類群乳菇屬物種多樣性進行了鑒定分析，旨在為科學開發乳菇屬物種資源提供指導。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

樣本調查采集采用樣線調查方法，于2017年7—10月在呂梁山北部的管涔山、中部的關帝山和南部的五鹿山進行。在每個調查區域，選定3～4條調查路線，涵蓋不同海拔高度的主要針葉林類型，包括亞高山云杉、落葉松針葉林，高緯度低海拔和低緯度的油松林、白皮松林等（表1）。在進行調查和標本采集過程中，通過航跡儀記錄采集路線，詳細觀察并記錄調查區域的植被情況，拍攝群落外貌、生境、子實體特征數碼照片，像素不小于600萬。記錄的主要特征包括子實體的大小，菌蓋顏色及大小，菌褶顏色及疏密，菌柄形狀、長度及直徑，菌肉顏色及變色情況，氣味和味道，乳汁的顏色及變色情況等；每份標本均制備2份材料，一份采用蘑菇干燥器烘干，用作憑證標本，另一份采用硅膠干燥，以備后續分子鑒定使用。

表1 本研究采集的山西呂梁山針葉林乳菇屬Lactarius樣本信息

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學方法 試驗對擔子果的宏觀特征在手持放大鏡和體視顯微鏡下進行觀察和描述，主要包括擔子果的形狀、大小、顏色、菌褶及菌柄特征等。

擔子果的顯微結構特征觀察在山西省農業科學院食用菌研究所微生物實驗室光學顯微鏡下進

行。首先采用手術刀進行徒手切片，以蒸餾水、3%的KOH作為浮載劑制作水封片。用棉蘭（cotton blue）和梅氏試劑（Melzer）來檢驗擔孢子壁有無喜蘭和淀粉質反應。

1.2.2 分子方法 DNA分子研究在北京首都師范大學生命科學學院微生物實驗室進行，用于本研究的樣本DNA提取、PCR以及測序方法等完全采用了FAN等[6]研究塊菌屬物種所使用的方法。其他用于本研究比對的DNA序列下載自NCBI數據庫，本研究成功提取和測序的nrDNA-ITS序列采用BLAST軟件在NCBI上進行比對，比對結果中相似性高于97%的序列用于本研究分析。

2 結果與分析

2.1 DNA-ITS比對結果

每個樣本序列選取比對到的3條相似度較高的序列，結合形態學特征對樣本進行鑒定（表2）。

表2 本研究部分引證樣本在NCBI上的比對結果一覽

2.2 分類學結果

對每份采集的標本，采用形態分類結合分子鑒定的方法進行鑒定。在形態分類中，結合野外采集拍攝的照片、記錄的宏觀形態特征以及在室內顯微鏡下觀察的形態特征，如孢子形狀及大小，擔子的形狀和大小，囊狀體的有無、形狀和大小以及菌蓋表皮的特征等，對物種進行鑒定。

本研究在山西呂梁山針葉林內鑒定出乳菇屬常見物種4種。

2.2.1 云杉乳菇 （Lactarius deterrimusGr?ger，Westf?lische Pilzbriefe 7∶10（1968）） 其菌蓋幼時扁半球形，中央部分平坦或稍下凹，邊緣內卷，后漸平展，成熟后上翻，邊緣波浪狀，有時呈漏斗形，直徑2～12 cm，潮濕時有點黏，胡蘿卜色或橙黃色，典型時多具深淺相間的同心環紋，在潮濕環境下環紋有時無或不明顯，老熟后或寒冷條件下部分或全部表面成污綠色；菌褶較密，延生，橙紅色；菌柄圓柱狀，與菌蓋同色，表面平滑，長3～8 cm，粗1～2 cm，初中實、后期漸漸中空；菌肉厚，淺黃色、橙黃色到橙紅色，酥脆，受傷處通常流出橙紅色乳汁，但有時乳汁量少或不明顯，乳汁有點苦，乳汁會將受傷處菌肉染成綠色。孢子無色，近球形到廣橢圓形，（7.5～10.0）μm×（6.0～7.5）μm，表面具有短脊形成的不完整網狀紋飾。8—9月生長在云杉（Picea sp.）林內地上，單生或群生（圖 1）。

本研究采集的呂梁山樣本形態和生長環境與歐洲的云杉乳菇高度吻合，ITS分析比對結果中除Lactarius deterrimus（相似度99%）外，出現2條Lactarius fennoscandicus名下序列，且相似度也高達99%（表2）。云杉乳菇與Lactarius fennoscandicus很相似，后者是不久前從前者分離出來的一個種類，其菌蓋顏色有點偏褐色，菌肉受傷后變藍綠色，乳汁與空氣變綠灰色[7]。因此，我們相信NCBI數據庫中這2條序列（EF685061和KX095055）實際上是云杉乳菇，而不是分布于北歐陰暗針葉林（泰加林）中的Lactarius fennoscandicus。云杉乳菇廣布于歐亞大陸，北美洲沒有分布記錄，我國文獻記載其分布于東北和青藏地區[8]，此前山西沒有記載[4]。

云杉乳菇在形態上與松乳菇很相似，但區別在于松乳菇菌蓋不會在老熟后出現大面積綠色，而且菌柄表面有明顯的窩斑，且只生長在油松林林內（山西）。云杉乳菇在歐洲也是著名的食用和貿易品種，與松乳菇相比，味道稍有點苦，食用量大時人的尿液也會變成紅色[9]，但對身體無害，停止食用后即可恢復正常顏色。

2.2.2 松乳菇（Lactarius deliciosus（L.）Gray，Nat.Arr.Brit.Pl.（London）1∶624（1821）） 其菌蓋扁平或扁半球形，邊緣內卷，后漸平展，中央部分平坦或稍下凹，邊緣完整，直徑3～10 cm，潮濕時有點黏，肉色、胡蘿卜色或淺橙黃色，多具深淺相間的同心環紋；菌褶較密，延生，橙紅色；菌柄圓柱狀，與菌蓋同色，長3～6 cm，粗1.5～2 cm，表面多具有明顯的大小不一的圓形或橢圓形凹斑，初中實、后期漸漸中空；菌肉厚，淺黃色、橙黃色到橙紅色，酥脆，受傷處變藍綠色，通常流出橙紅色乳汁，乳汁淡味或甜，但有時乳汁量少。孢子無色，近球形到廣橢圓形，（8.0～10.5）μm×（6.5～7.5）μm，表面具有小疣和短脊形成的不完整網狀紋飾。8—9月生長在油松（Pinus tabulaeformis）林內地上，單生或群生（圖2）。

劉波[4]在《山西大型食用真菌》中沒有記載該物種在呂梁山分布，但描述了其在山西南部有發生。本研究沒有發現該報告的引證樣本，但在關帝山和五鹿山油松林內采到的樣本從形態特征和DNA數據均證實了這個物種在山西針葉林內的存在（表1，2）。有研究報告顯示，松乳菇是松屬Pinus植物的嚴格菌根菌，在歐洲生長在Pinus nigra和Pinus brutia林內，是產量很大的優勢物種；在新西蘭，它和歐洲引入的Pinus radiate生長在一起。在山西，本研究在呂梁山區發現其只在油松林內。松乳菇主要分布于歐洲和亞洲，最近的研究發現，北美洲的相似種類與歐亞松乳茹不是一個演化譜系[10]。

2.2.3 窩柄黃乳菇（Lactarius scrobiculatus（Scop.）Fr.，Epicr.syst.mycol.（Upsaliae）∶334（1838）） 其菌蓋初期扁半球形到半球形，邊緣內卷，后漸漸平展，中央部分下凹呈或多或少的淺杯狀，直徑4～18 cm，黃色或有時有點黃綠色，有明顯或不明顯深淺相間的同心環紋，有時邊緣處有短而密的柔毛；菌褶乳白色至黃色，后期偏灰暗色，褶密，延生；菌柄圓柱狀，與菌蓋同色，長3～5 cm，粗1～3 cm，與菌蓋直徑相比相當粗短，表面典型情況下具有明顯的大小不一的近圓形或橢圓形的淺色凹斑；菌肉白色，厚，受傷后變為暗黃色，傷處通常流出少量白色乳汁，味苦，在山西呂梁山林區，該物種乳汁量少。孢子球形，無色，直徑6.5～8.0 μm，表明具有小刺狀紋飾。8—9月生長在云杉（Picea sp.）林內地上，單生或群生（圖3）。

窩柄黃乳菇是一個特征明顯的乳菇屬物種，山西有文獻記載該物種的分布[4]，本研究中的呂梁山樣本ITS分子數據也支持了這個物種在山西的存在（表 2）。該物種在我國各地均有分布[8，11]，文獻記載其為毒菌，主要產生胃腸炎型中毒反應，但在北歐和俄羅斯等地也有鹽漬或煮后食用的報道[12]。但我國最新的一本毒菌專著中沒有收錄該物種[13]。

2.2.4 毛頭乳菇 （Lactarius torminosus（Schaeff.）Gray，Nat.Arr.Brit.Pl（.London）1∶623（1821）） 其菌蓋初期扁半球形，邊緣明顯內卷，中央部分或多或少下凹，后漸漸平展，直徑成淺的漏斗狀，直徑2～12 cm，肉色、淺胡蘿卜色到蝦紅色，典型情況下表面有明顯或不明顯的深淺相間的同心環，但完全沒有同心環的子實體也很常見，表面多具有明顯的白色柔毛，尤其在子實體發育幼小時期，其菌蓋邊緣具有長的氈毛狀幾乎包裹了菌褶，但發育后期菌蓋上的毛狀物逐漸脫落，最后菌蓋表面接近光滑；菌褶密，初期白色，后漸變為粉白色或淺肉褐色，延生；菌柄圓柱狀，與菌蓋表面同色，表面平滑或有初期有不明顯的粉粒狀附著物，長1.5～7.0cm，粗0.8～2.0 cm；菌肉白色到淺肉色，受傷不變色，但通常會流出白色到奶油色的乳汁，乳汁有點辛辣和刺激的味道，在山西呂梁山林區，該物種乳汁量少或通常不明顯。孢子近球形到廣橢圓形，（8～10）μm×（5.5～6.5）μm，表面具有有短脊和小疣形成的不完整網狀紋飾。7—9月生長在華北落葉松林Larix sp.和樺Betula sp.混交林內地上，單生或群生（圖4）。

現有資料中，毛頭乳菇這個在我國各地廣布的物種此前在山西沒有記載[4]。該物種最早報道于歐洲，是北溫帶地區分布最廣泛的乳菇屬物種之一。本研究采集的山西呂梁山樣本形態學特征與歐洲文獻描述吻合，ITS分子數據比對結果也支持該結果（表2）。其肉色到蝦紅色的菌蓋、氈毛狀的菌蓋邊緣以及白色辛辣的乳汁，結合在樺木樹下的生長環境可以準確識別該物種[14]。該物種可能與樺屬（Betula spp.）樹木有專一性的菌根共生關系[15]。

我國文獻中將毛頭乳菇記載為毒菌[8，11]，但是最新的一本毒菌專著中沒有收錄這個物種[13]。歐洲文獻記載這個物種生食時會有中毒反應，主要表現為胃腸炎型癥狀，包括惡心、嘔吐、腹瀉等，通常在食用后1 h出現反應，嚴重時會導致脫水、肌肉痙攣、循環衰竭等，但是這些癥狀通常會在幾天內自愈[16]，現在知道導致胃腸炎癥反應的是絨白乳菇醛（velleral）的化合物[17]。盡管毛頭乳菇生吃有毒性反應，但是芬蘭、俄羅斯等歐洲國家確有通過預先煮到半熟、鹽漬或酸洗等方法食用這種蘑菇的傳統。在挪威，人們將這種蘑菇烘焙后加在咖啡中飲用[14]。

3 討論

本次研究從山西呂梁山針葉林中采到的乳菇屬樣本中，采用形態學和DNA分子相結合的方法共鑒定出4個物種，除窩柄黃乳菇外，其余3個物種都是在該地區針葉林中的首次記錄。盡管可能有種類尚未發現，但根據我們的野外樣線范圍內目測觀察，這4個大型物種基本構成了本區域針葉林內乳菇屬主要資源，是現階段的主要和優勢物種。劉波等[4]在山西大型食用真菌中記載的分布于管涔山一帶針葉林中的紅汁乳菇Lactarius hatsudake和辣味乳菇Lactarius piperatus（現在的名稱為Lactifluuspiperatus）在本次研究中沒有發現。根據其記載紅汁乳菇產量很大、生長在云杉林內的描述，我們推測作者可能將云杉乳菇錯誤鑒定為紅汁乳菇。這2種乳菇在形態特征上很相似，但紅汁乳菇菌蓋沒有云杉乳菇那么多綠色，乳汁血紅色而且生長在松樹林內，在我國多分布于南方偏暖地區。辣味乳菇是一個白色物種，與樺木形成菌根，針葉林內如確有分布應該在含有樺木的混交林中。

多種乳菇屬物種是傳統的食用菌，尤其在歐洲地區，以松乳菇、云杉乳菇最為著名和具代表性，是國際市場上的貿易品種。在我國云南一帶，人們也有采食習慣，當地又稱奶漿菌、銅鑼菌、谷熟菌等。在山西中北部針葉林中，這2個物種極為常見，但當地百姓沒有采食習慣，基本上處于自生自滅狀態。乳菇屬物種有潛在的藥用價值，最新的研究發現，云杉乳菇的提取液在糖尿病誘導的大鼠模型試驗中產生了對胰島素有保護作用的積極效果，意味著這種野生蘑菇資源可能會為糖尿病患者帶來福音[18]。山西中北部高山地區有相當大面積的天然云杉次生林，在管涔山高橋哇林場，云杉乳菇可能是林中產量最大的蘑菇之一。此外，有研究顯示，乳菇屬物種在云杉菌根菌群落中屬于中期出現的替代物種，根據地面蘑菇產量來判斷，它是當地的優勢物種，這意味著其產量有相當長時間的穩定性，具有持續商業開發基礎。

利用菌根合成技術在野外栽培松乳菇在新西蘭取得了重要進展。松乳菇原產歐洲，南半球原本沒有該物種的自然分布，它是隨著寄主樹木一起被意外從歐洲引進的。第1棵感染有松乳菇的輻射松（Pinus radiata）幼苗在2000年8月種下，126 d后發現產生了松乳菇子實體，到2003年已經收獲了商業產量；在2009年，每棵樹周邊的松乳菇平均收獲6 kg左右，超過了30 a齡母樹本身的價值。山西有著豐富的油松資源，也是本地最重要的造林樹種，而本研究發現，在呂梁山區的人工油松林下有本土的松乳菇種群分布。因此，如何借鑒新西蘭的成功經驗，將油松和松乳菇結合起來研究和發展，是我們菌類研究工作者應該考慮的問題之一。

許多外生菌根菌有寄主植物專一性特點，乳菇屬物種表現尤為明顯。本研究在山西呂梁上發現的這4中乳菇都表現出特定的寄主植物對應關系，如松乳菇→油松，云杉乳菇→云杉，窩柄黃乳菇→云杉，毛頭乳菇→樺木。這種關聯關系是長期演化的結果，除了可以用來幫助物種鑒別，也可用來引導我們在菌根菌合成研究和應用中選定寄主樹種。

近年來，山西缺乏大型野生菌類資源方面的研究報告，山西菌類資源僅有的本地記錄仍停留在20多年前建立在形態學特征基礎上的物種記錄，也就是說，完全的形態物種（morphological species）階段。然而，由于存在環境對物種形態的影響（如溫度和光照對顏色等）、子實體個體發育階段的不同特征、趨同演化、隱存種（cryptic species）等現象，以形態學特征為基礎的手段和方法不可避免地會存在物種鑒定錯誤的問題。此外，野生菌類資源是動態的，舊物種消失和新物種出現的物種替代現象每時每刻都在發生。例如，管涔山地區20世紀90年代初發現的松茸Tricholoma matsutake在當地已經消失不見，還有當地華北落葉松林下常見的蜂窩孢豬塊菌Choiromyces alevolatus可能已被該屬另一個物種賀蘭山豬塊菌Choiromyces helanshanense所替代，這些都曾經是山西重要的森林菌根菌資源。因此，有必要用現代DNA分子方法對山西大型真菌做一次系統的普查，從生態價值、經濟價值等方面對重要的物種做出分類、分級評價，對選定的重點物種進行進一步深入研究和定時定點監控觀察（如重要的商業物種、生態群落的優勢物種等），以便掌握山西主要的菌類物種資源的動態變化，為我們能夠科學有效的開發利用這些珍貴的資源奠定基礎。

志謝：感謝曹晉忠博士對本文提供有價值的意見，首都師范大學研究生閆向遠、黃凱兵、陳萌、李婷、徐語言參加標本采集及部分試驗工作，在此一并致謝。