21株尖鐮孢菌SSR遺傳多樣性分析

王育選，王建明，呂藝瑤，李新鳳

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）具有易變異、毒力變化快以及種下專化型和生理小種較多的特點，給農戶帶來防治困難[1]。因此，明確菌株間的本質差異和群體遺傳結構，不僅可實現該病害防治過程中對癥下藥，而且還可為選育抗病品種提供理論依據。分子標記技術則從基因層面對病原的進化關系進行分析，可清晰地分析出不同尖鐮孢菌之間的進化關系。

目前，應用較為廣泛的分子標記技術主要有RFLP[2-3]，RAPD[4-6]，rDNA-ITS[7-8]，ISSR[9]和 SSR[10]等，其中，SSR標記優勢明顯，該技術為共顯形，且在基因組中分散分布及具有豐富的多態性[11-12]，其已被應用于番茄灰霉病菌[13]、大豆疫霉病菌[14-15]、蘋果黑星病菌[16-17]等病原真菌遺傳多樣性分析的研究中。張述義等[18]、李新鳳等[19]分別采用ISSR和EST-SSR對尖鐮孢菌進行了遺傳多樣性研究，但有關利用Genomic-SSR標記對尖鐮孢菌遺傳多樣性的研究還未見相關報道。

本研究利用全基因組SSR-PCR技術對山西省不同地區不同寄主的19株尖鐮孢菌與河北的2株尖鐮孢菌的寄主和地理來源與遺傳多樣性的關系進行分析，旨在為明確山西地區尖鐮孢菌的進化關系和遺傳多樣性提供理論依據，為山西地區該病害防治提供理論參考，為該類病害抗病育種提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及來源 21株尖鐮孢菌由山西農業大學植物病理重點實驗室單孢分離并保存，其詳細情況如表1所示。

1.1.2 供試引物 選取尖鐮孢菌全基因組中符合條件的SSR序列[20]，利用Primer 5.0軟件進行引物設計，送由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 供試菌株及來源

1.2 試驗儀器

C1000/C100 PCR基因擴增儀（美國BIORAD公司），HT-SCZ04C型垂直電泳槽（北京鴻濤基業科技發展有限責任公司），冷凍離心機（德國Eppendorf公司），紫外/可見光/熒光分光光度計（美國BIORAD公司），移液器、分析天平（德國賽多利斯公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲培養 用PDA培養基在25℃定溫培養箱中培養供試菌株3～5 d，之后在菌株邊緣取少量菌絲轉移到查彼液體培養基（硝酸鈉2 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，蔗糖 30 g）中培養，于 25℃，150～200 r/min培養2～3 d，過濾得到菌絲。

1.3.2 CTAB法提取DNA 參考LODHI等[21]的方法對尖鐮孢菌基因組DNA進行提取：稱取50 mg菌絲于2 mL離心管內，加液氮研磨；在離心管內加500 μL提取液，60℃水浴60 min；在離心管內加64 μL 的 10%（m/V）CTAB 和 140 μL 的 5 mol/L NaCl，65℃水浴10 min；將200 μL的氯仿異戊醇（24∶1）加入離心管，于4℃下離心10 min，轉速14 000 r/min，進行基因組DNA的抽提，相同過程執行3次；取上清液于另一1.5 mL無菌離心管中，加入0.6倍體積預冷的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc（pH值為5.2），于-20℃下過夜，沉淀基因組DNA；4℃下14 000 r/min離心10 min，沉淀DNA，去掉上清液，然后用70%乙醇洗滌2次，在超凈工作臺上吹干；將風干的DNA溶于50 μL TE（或ddH2O）中于-20℃保存。

1.3.3 基因組SSR引物篩選 本試驗共合成60對SSR引物，自供試尖鐮孢菌中，隨機選取3株基因組DNA為模板，進行PCR擴增，從中選取擴增效果好、具有豐富多態性的引物，用于21株尖鐮孢菌的PCR擴增。PCR 擴增體系：模板DNA（20ng）1 μL，Trans Taq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.2 μL，10×Easy Taq Buffer for PAGE（+Mg2+）2 μL，上下游引物（0.25 μmol/L）各 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，ddH2O 補足 20 μL。

反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，退火40 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。將PCR擴增產物保存于4℃冰箱內（退火溫度參照引物合成報告單）。

1.3.4 PCR產物PAGE電泳檢測 用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離PCR擴增產物，180 V恒電壓下，電泳2 h。然后，參考BASSAM等[22]的方法，用現配的0.1%AgNO3溶液銀染10～15 min，去離子水沖洗3次后，置于顯影液中進行顯影，直至條帶清晰，最后用照相機拍照記錄試驗結果。

1.4 數據記錄與分析

觀察電泳擴增條帶，分別用1和0記錄同一遷移率位置上條帶的有和無，用NTSYS-pc Version 2.10s軟件計算供試菌株間的遺傳相似系數，并進行遺傳相似性分析、聚類分析（UPGAM）。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

供試60對SSR引物中，多態性明顯且擴增效果好的引物共11對。

以21株供試尖鐮孢菌為模板，利用篩選出的11對引物對其進行PCR擴增，結果列于表2。從表2可以看出，共擴增出39條譜帶，多數條帶分布在300～500 bp（圖1），其中，多態性條帶為39條，多態性比例為100%。平均每個引物產生3.6條多態性條帶。

2.2 供試的尖鐮孢菌的相似性系數矩陣分析

試驗結果表明（表3），供試菌株之間的遺傳相似系數為0.43～0.94，平均為0.662。其中，相似系數最大、親緣關系最近的菌株有3對，分別為分離自祁縣綠豆2號和3號菌株、運城棉花17號和19號菌株和河北保定蘭花20號和21號菌株；來自大同番茄的15號菌株與來自祁縣茄子的1號菌株以及分離自太谷的蠶豆4號菌株、蠶豆5號菌株、西葫蘆8號菌株之間的遺傳相似系數最小，說明它們之間的親緣關系較遠。

表2 供試尖鐮孢菌SSR-PCR擴增效果

另外，菌株間的遺傳差異與其寄主和地理來源之間的關系較為復雜，多數寄主和地理來源相同的菌株間的遺傳相似系數較不同寄主和地理來源的菌株間的大；而有的菌株剛好相反，如分離自棉花的17號、18號與19號菌株中，來自運城17號和19號菌株間的遺傳相似系數（0.94）明顯高于其各自與太谷18號菌株的遺傳相似系數（0.89，0.89），分離自黃瓜的太谷10號和12號菌株間的相似系數（0.89）高于其分別與夏縣9號、太原11號菌株的遺傳相似系數（0.69，0.59）。同是分離自番茄的大同15號菌株和太谷14號間的遺傳相似系數（0.53）比其與長治蘭花16號菌株間的遺傳相似系數（0.64）小。

表3 21株尖鐮孢菌SSR擴增多態性相似性系數矩陣

2.3 21株尖鐮孢菌SSR-PCR擴增結果的聚類分析

聚類分析結果表明（圖2），尖鐮孢菌菌株類群間總體遺傳相似系數在0.56～0.95，當遺傳相似系數為0.56時，21株尖鐮孢菌可分成2個SSR類群（SSR groups，SG）；當相似系數為 0.70時，21株尖鐮孢菌可分成5個SSR亞類群；當相似系數為0.95時，21株尖鐮孢菌可完全分開。可見，尖鐮孢菌基因組DNA的SSR區域存在明顯的遺傳分化，初步說明全基因組SSR標記技術用于研究尖鐮孢菌遺傳分化是有效可行的。

同一地理來源不同寄主的菌株分散在不同的類群或亞類群（圖2），如分離自夏縣的黃瓜9號和西瓜13號菌株、祁縣的茄子1號和綠豆2號菌株、太谷的地豆6號和蠶豆5號菌株；有些寄主來源相同而地理來源不同的菌株聚于不同類群，如分離自太谷縣番茄（14號）與大同番茄（15號）分別聚在了SG-1和SG-2中（圖2）。

另外，雖然分離自黃瓜的9號、10號、11號和12號聚在了不同類群，但來自夏縣黃瓜9號和太原黃瓜11號聚在一支上，太谷黃瓜10號和12號聚在了一起；分離自運城棉花17號和19號菌株聚在一起，然后和太谷棉花18號聚在一起，分離自河北蘭花的20號和21號菌株優先聚在一起，然后才和分離自長治蘭花的16號菌株聚在一起。說明分離自相同寄主的菌株，其遺傳相似性與地理來源存在一定的相關性。

3 討論

本試驗從供試60對多態性引物中，篩選出11對多態引物，其中，最多的為五核苷酸重復序列，共有5對。而陳長卿[23]對中國小麥條銹病菌進行群體遺傳結構分析，結果表明，二堿基和三堿基重復的多態性比三堿基以上重復類型的多態性高。這可能與試驗材料不同以及尖鐮孢菌全基因組SSR位點中五核苷酸為主要重復類型有關[20，24-26]。

聚類分析結果顯示，遺傳相似系數越大，供試菌株劃分的亞類群越多，當相似系數為0.95時，供試尖鐮孢菌菌株全部分開。分離自番茄的2個菌株分在不同的類群中，但分離自黃瓜的9號和11號菌株聚集在一個分支上，說明并不是所有的相同寄主不同地理來源的菌株都不能聚到一起。分離自河北蘭花的20號和21號菌株比長治蘭花16號菌株優先聚在一起，說明寄主相同的菌株之間的親緣關系與地理來源有關。可見，在寄主相同時，SSR類群劃分與其地理位置具有一定關系。

相似系數矩陣分析表明，供試各個菌株之間的遺傳相似系數為0.43～0.94，平均為0.662。寄主和地區不同的菌株相似系數比寄主或地區相同的菌株相似系數大，有的則相反。表明有的菌株間的遺傳系數與寄主和來源沒有明顯的關聯。而分離自黃瓜的4個菌株及分離自棉花的3個菌株優先聚在一起的現象，又說明寄主相同的菌株間的相似性與其地理來源有一定的關聯。寄主和地理來源都相同的菌株間也存在遺傳差異，表明供試的各菌株在全基因組SSR區域有一定的遺傳差異。

另外，本研究還發現，供試菌株的遺傳多樣性與地理來源相關性較小，這與苑琳等[26]利用SSR標記研究擬輪枝鐮孢的遺傳多樣性分析與地區分布沒有明顯關聯的結果不同，這可能與本研究所用供試菌株數量和分布存在一定局限性有關。

本研究結果初步說明基因組SSR標記用于尖鐮孢菌遺傳多樣性分析是可行的，但在本研究結果中仍有個別菌株寄主和地理來源相同但沒能優先聚在一起，可能是由于供試菌株數量有限有關，因此，在后續研究中還需在增加菌株數量的基礎上，利用全基因組SSR標記對山西地區的尖鐮孢菌遺傳多樣性進行進一步研究。